В модификации Дэвени и Гергей

Метод Лоури основан на реакции взаимодействия фенольного реактива Фолина – Чокалтеу с щелочными растворами белков, приводящей к образованию продуктов реакции синего цвета. Интенсивность окраски зависит от содержания в исследуемом белке тирозина и триптофана. Оптическую плотность окрашенных растворов измеряют при длине волны 750 нм.

Метод рекомендуется для определения массовой доли белка в сильно разбавленных растворах, при наблюдении за ходом ферментативных процессов, для определения белков молока, фракционированных растительных белков.

Реактивы: Реактив А. Раствор Na₂CO₃ массовой долей 2 % в растворе NaOH концентрацией 0,1 моль/дм³. Реактив В. Раствор CuSO₄ • Н₂О массовой долей 0,5 % в растворе тартрата натрия с массовой долей 1 %. Реактив С. Получают смешиванием 60 см³ реактива А и 1 см³ реактива В (готовят непосредственно перед определением). Реактив Д. Непосредственно перед использованием реактив Фолина – Чокалтеу титруют по фенолфталеину раствором гидроксида натрия известной молярной концентрации и по полученным результатам разбавляют до концентрации раствора 1 моль/дм³

Рис. 7. Зависимость логарифма молекулярной массы (lg Мr) белков от объема элюата (V_е): 1-голубой декстран; 2-бычий альбумин; 3-пероксидаза; 4- трипсин; 5-лизоцим

Проведение анализа. К 0,2 см³ исследуемого раствора, содержащего 5 – 100 мкг белка, прибавляют 1 см³ реактива С, смешивают и через 10 мин быстро вносят 0,1 см³ реактива Д, встряхивают и оставляют при температуре (20 ±5) ^оС на 30 мин, а затем снимают показания на спектрофотометре при λ = 750 нм.

Построение градуировочного графика. Содержание белка в растворе определяют по графику, который строят с использованием раствора тирозина известной концентрации. Для приготовления стандартного раствора 20 мг кристаллического тирозина растворяют в 200 см³ раствора соляной кислоты молярной концентрацией 0,2 моль/дм³. Градуировочный график строят, используя растворы тирозина с рекомендуемой массовой концентрацией (табл. 7).

Таблица 7

Поиск по сайту: