АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

Концентрирование ГБ метом ультрафильтрации

Читайте также:
  1. II. ЖЕЛАНИЕ СВЯЗЫВАЕТ ЧЕЛОВЕКА С ПРЕДМЕТОМ ЖЕЛАНИЯ
  2. Атаманское завоевание Европы XV века фараоном Тутмесом – Магометом
  3. Б) Маркс вважав, що суперечність у трудовій теорії вартості Сміта- Рікардо розв’язується, якщо предметом купівлі-продажу вважати робочу силу, а не працю.
  4. Запит стосується кримінального правопорушення, яке є предметом досудового розслідування або судового розгляду в Україні.
  5. Майно, яке не може бути предметом вкладу до статутного капіталу
  6. ОБЖ проводится интегрировано с предметом Окружающий мир один раз в неделю по 15 минут от урока, 34 занятия в год.
  7. С именем Аллаха любым предметом, кроме зубов и когтей, потому что зубы
  8. Список городов, завоеванных Тутмесом-Магометом
  9. СТРАХОВЫЕ КОМПАНИИ, УЧАСТВУЮЩИЕ В СТРАХОВАНИИ ИМУЩЕСТВА, ЯВЛЯЮЩЕГОСЯ ПРЕДМЕТОМ ЗАЛОГА
  10. Тема 1. Введение. Знакомство с предметом и основными понятиями основ научных исследований
  11. Установление факта отпирания замка посторонним предметом

Объединённые фракции трёх с трёх разрушений объёмом 81 мл разбавили буфером (20 мМ Трис HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8.5) в 3,5 раза до 300 мл (концентрация белка 0,19 мг/мл) и концентрировали на приборе для ультрафильтрации Amicon (мембрана YM 30) в 15 раз. В результате получили 20 мл раствора с концентрацией ГБ 2,2 мг/мл.

Сайтспецифическое расщепление гибридного белка TEV протеазой.

К концентрату добавили экстракт телец TEV до соотношения фермент–субстрат 1:100 и дитиотриэтол до 1мМ, инкубировали 15 часов при 37oС. Реакционную смесь нанесли на колонку HiTrap Heparin Sepharose (5 мл) и хроматографироговали по ранее описанной методике. Фракции, содержащие целевой белок были объединены и сконцентрированы.

Высокоэффективная жидкостная хроматография на колонке Диасорб С18

Очистку осуществляли на колонке Диасорб-130 –С16Т 7 мкм, 16×250 мм в градиенте концентрации 30%-50% ацетонитрила с 0,1% ТФУ при скорости потока 5 мл/мин в течение 35 мин. Фракции, содержащие чистотой более 98%, объединяли и лиофилизировали. Итоговый белок составил 11,5 мг.

Электрофорез белков в ПААГ

Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили в полиакриламидном геле (система Laemmli.).В качестве маркеров молекулярных масс использовали набор “Kalibration kit": молекулярный вес - 14.4, 20.1, 30.0, 43.0, 67.0, 94.0 кДа (Pharmacia).

Использовали двухступенчатый гель: верхний (концентрирующий) — 3,5% ПААГ в буфере UTB, нижний (разделяющий) — 15% ПААГ в буфере LTB с инициатором полимеризации персульфата аммония (1/100 объема геля) катализатором полимеризации и TEMED (1/1000 объема). Размер и толщина геля определялся размерами стёкл, толщиной спейсеров и составлял 9х12х0,05 см.

Электрофорез проводили в 1х трис-глициновом буфере с SDS при постоянном силе тока в 22 мА. Электрофорез прекращали, когда фронт красителя бромфенолового синего не выходил в буфер. Затем гель помещали на 15 минут в фиксирующий раствор (10% ТХУ, 10% метанол), потом - на 15 минут в красящий раствор (0,2% Кумаси R-250, 10% уксусной кислоты, 10% изопропанола) при 60ºС. Краску геля отмывали кипячением в 5%-ом растворе уксусной кислоты.

Определение концентрации белка методом Бредфорд.

Реактив Бредфорд готовили следующим образом: кумасси бриллиантовый синий G-250 (100 мг) растворяли в 50 мл 95% - ного EtOH. К полуяеному раствору добавили 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты и водой довили объём смеси до 1л.

К анализируемому образцу, содержащему белок в диапазоне 0,5 -9 мг/мл добавили 2,5 мл реагента-красителя и хорошо перемешали. Измеряли поглощение при длине волны 595 нм относительно чистого реагента.

Концентрацию белка находили по градуировочному графику построенному по БСА.


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |

Поиск по сайту:

Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.003 сек.)