АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

Цитограмма 8: A

Читайте также:
  1. Ситуационные задачи.

 

Создать прямоугольную область J. Она охватит все события, соответствующие жизнеспособным клеткам (негативные по 7-AAD).

 

3. Расстановка гейтов

 

Цитограмма 1

 

Установить гейт «J» - включение всех жизнеспособных клеток. Если 7-AAD неиспользуется, то наложите дополнительный гейт «-H» для исключения счётных частиц Stem-Count вместе с их дублетами.

Область A предусмотрена, чтобы охватывать 100 %жизнеспособных белых клеток. Счёт в ней (колонка «Count» в таблице статистик) ставится в знаменатель формулы относительной концентрации CD34+ гемопоэтических стволовых клеток.

 

Цитограмма 2

 

Установите гейт «AJ» - включение всех жизнеспособных клеток (или просто «A», если 7-AAD не используется)

Цитограмма 3

 

Установите гейт «ABJ» - включение всех жизнеспособных CD45+CD34+ клеток (или просто «AB», если 7-AAD не используется).

 

Цитограмма 4

 

Установите гейт «ABCJ» - включение всех жизнеспособных CD45+CD34+ клеток с низким уровнем сигнала бокового светорассеяния при исключении дебриса и тромбоцитов. Область D на этой цитограмме охватывает все истинные жизнеспособные CD34+ гемопоэтические стволовые клетки (если 7-AAD не используется, установите гейт «ABC»).

По окончании анализа для области Dв колонке «Count» таблицы статистик будет отображена абсолютная концентрация CD34+ ГСК или контрольных клеток Stem-Trol Cells.

 

Цитограмма 5

 

Эта цитограмма остаётся негейтированной для отображения всех событий.

 

 

Цитограмма 6

 

Установите гейт «EJ» - отображение жизнеспособных лимфоцитов, которые будут использоваться как визуальный контроль правильности установки дискриминатора (если 7-AAD не используется, установите гейт «E»).

 

Цитограмма 7

 

Установите гейт «H» - отображение счётных частиц Stem-Count Fluorospheres, включая дублеты.

 

Цитограмма 8

 

Установите гейт «A» - отображение CD45+ событий.

 

4. Настройка аппаратных параметров протокола

 

Обеспечьте правильную настройку интенсивности сигнала в каналах светорассеяния и флуоресценции в соответствии с указаниями инструкции фирмы-производителя цитометра. Отрегулируйте параметры цветовой компенсации.

 

Перемешайте пробы в течение 5 секунд на вортексе.

Выполните сбор данных на проточном цитометре.

Необходимо накопить не менее 75 000 событий CD45+.

 

Для анализа образцов: Отрегулируйте дискриминатор и положения регионов при анализе пробы в пробирке (1). Сохраните протокол и проводите анализ проб (2) и (3) без дальнейшей коррекции настроек.

 

5. Расчёт концентрации CD34+ ГСК в образце.

 

Количество CD34+ ГСК рассчитывается как среднее значение статистики «Count», выданной по области D в двух повторах проб – пробирках (1) и (2).

Результат подсчёта считается достоверным, если аналогичный результат, полученный в контрольной пробе (3) не превышает 10 % от полученного в тестовых пробах.

 

Усредните результат, полученный по пробам (1) и (2) для области D. Количество CD34+ ГСК в отдельно взятой пробе из дубля не должно отклоняться от среднего более, чем на 10%. Величина, полученная в контрольной пробе, должна представлять менее 10 % средней величины, полученной в дубле тестовых проб.

 

ЗАМЕЧАНИЯ: Если разброс в дубле составляет более 10 % от среднего значения,

проверьте, не происходит ли эта ошибка по причине неточного дозирования. Особенное

внимание следует обратить на точность дозирования образца и суспензии контрольных

частиц. Визуально оцените сходство диаграмм на распечатанных графических отчётах,

качество лизиса красной крови. Проверьте правильность установки границ областей.

 

При необходимости повторите сбор данных, проводя после пробы (1) и пробы (2)

промывку пробиркой с деионизованной водой или обжимающей жидкостью (BLANK). При необходимости повторите подготовку проб, включая BLANK. Проведите сбор данных в старой и новой сериях проб. Сравните результаты. При расхождениях обратитесь к представителю фирмы Beckman Coulter.

Если исследовался предварительно разведённый образец, то абсолютная концентрация клеток должна быть умножена на коэффициент разведения. Итоговый результат расчёта представляет собой абсолютную концентрацию CD34+ ГСК в клетках/мкл.

 

Абсолютная концентрация CD34+ ГСК = Статистика «Count» области D × Коэффициент разведении (клеток/мкл)

 

Для определения процентной концентрации CD34+ ГСК относительно всех CD45-позитивных клеток применяйте следующую формулу:

 

.

6. Распечатать результаты.

7. Заполнить протокол по определению CD 34+ ГСК и их жизнеспособности.


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |

Поиск по сайту:

Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.005 сек.)