Понятие и основа репликации

Введение.

Вся информация о строении и функционировании любого организма содержится в закодированном виде в его ге­нетическом материале, основу которого у подавляющего числа организмов составляетДНК.
Роль ДНК заключа­ется в хранении и пере­даче генети­ческой (наследственной) информации в живых организмах. Чтобы эта инфор­мация могла переда­ваться от одного поколения клеток (и организмов) к другому, необходимо её точное копиро­вание и после­дующее распределение её копий между потомками. Процесс, с помощью которого создаются копии молекулы ДНК, называется реплика­цией. Перед тем как раз­делится, клетки с помощью реп­ликации создают копию своего генома, и в результате клеточного деления в каждую дочер­нюю клетку переходит одна копия. Бла­годаря этому, генетическая информация, содержащаяся в роди­тельской клетке, не исчезает, а сохраняется и пере­даётся потомкам. В случае многоклеточных организмов пе­редача этой информации осуществляется с помощью половых клеток, образующихся в результате мейотического деления и также несущих копию генома (гаплоидного). Их слияние приводит к объеди­нению двух родительских геномов в одной клетке (зиготе). Из неё развивается организм, клетки которого не­сут ге­нетическую информацию обоих родительских организмов. Таким образом, основное значение репликации за­ключается в снабжении потомства генетической информацией. Для обеспечения стабильности организма и вида ДНК должна реплицироваться полностью и с очень высокой точностью, что обеспечивается функционированием определённого набора белков. Замечательной особенностью ДНК является то, что она несёт гены кодирующие эти белки, и, таким образом, информация о механизме её собственного удвоения за­кодирована в ней самой.

2)Эксперимент Мезельсона-Сталя — эксперимент, проведённый двумя молекулярными биологами — Мэтью Мезельсоном и Франклином Сталем, в 1958 году. Он показал, что репликация ДНК имеет полуконсервативный характер. Это означает, что каждая дочерняя ДНК состоит из одной матричной цепи и из одной недавно синтезированной цепи.

Рисунок, иллюстрирующий возможные механизмырепликации ДНК: полуконсервативная, консервативная идисперсная

Каждая молекула ДНК содержит множество атомов азота. Наиболее распространён изотоп азота 14N. Существует также изотоп 15N, он не радиоактивен, а лишь тяжелее 14N. На его основе можно синтезировать жизнеспособную ДНК.

Были выращены несколько поколений E. coli в среде, богатой 15N. Затем их ДНК было выделено и центрифугировано в градиенте плотность CsCl. Каждая молекула ДНК останавливалась около точки, где её плотность совпадает с плотностью раствора соли.

ДНК бактерий, выращенных в 15N среде было более тяжёлым. Эти бактерии затем были помещены обратно в 14N среду, где им было позволено разделится только один раз. Затем из клеток были извлечены ДНК, их вес оказался больше веса ДНК бактерий, выращенных в среде богатой 14N, но меньше веса ДНК бактерий, выращенных в 15N среде. Это противоречило гипотезе о консервативном характере репликации ДНК, когда одна дочерняя клетка получает материнскую ДНК, а вторая — вновь синтезированную, обе цепи которой — новые, так как в этом случае ДНК разделились бы на две фракции — лёгкую, из атомов 14N, и тяжёлую, из атомов 15N.

Однако этот результат не исключал дисперсный механизм репликации, когда куски материнской ДНК распределяются между дочерними ДНК случайным образом. Поэтому было выращено второе поколение бактерий, и их ДНК также было взвешено. Выяснилось, что клетки содержат как полностью «лёгкие» ДНК, так и «гибридные», этот факт позволил исключить гипотезу дисперсного механизма репликации. (2)

Понятие и основа репликации

Репликация (позднелат. replicatio — повторение, от лат. replico — обращаюсь назад, повторяю), редупликация, ауторепродукция, аутосинтез, протекающий во всех живых клетках процесс самовоспроизведения (самокопирования) нуклеиновых кислот, генов, хромосом.

Репликация ДНК — это процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты, который происходит в процессе деления клетки на матрице родительской молекулы ДНК. При этом генетический материал, зашифрованный в ДНК, удваивается и делится между дочерними клетками. Репликацию ДНК осуществляет фермент ДНК-полимераза.

В основе механизма репликация лежит ферментативный синтез дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или рибонуклеиновых кислот (РНК), осуществляемый по матричному принципу. Предложенная в 1953 Дж. Уотсоном и Ф. Криком модель строения ДНК — так называемая двойная спираль — с одной стороны, объяснила, каким образом записана генетическая информация в молекуле ДНК, с другой — позволила понять и экспериментально изучать химические механизмы удвоения генетического материала. Строгая специфичность спаривания азотистых оснований в молекуле ДНК обусловливает комплементарность последовательностей оснований в двух цепях и обеспечивает высокую точность Репликация Пара гуанин — цитозин стабилизируется тремя водородными связями, пара аденин — тимин — двумя, что резко снижает вероятность неправильного спаривания оснований. Согласно Уотсону и Крику, процесс Репликация ДНК предусматривает: 1) разрыв водородных связей и расплетение нитей двойной спирали; 2) синтез на одиночных нитях комплементарных цепей. В результате из одной двухцепочечной ДНК возникают две подобные молекулы, причём в каждой из дочерних молекул одна полинуклеотидная цепь родительская, а другая — синтезированная заново (полуконсервативный механизм Репликация).

У вирусов и фагов, имеющих однонитевую ДНК, Репликация идёт особым образом. После внедрения в клетку хозяина одноцепочечной ДНК, которую называют (+)-цепью, на ней, как на матрице, синтезируется комплементарная ей (—)-цепь. На образовавшейся двухспиральной молекуле (репликативная форма) синтезируются новые одноцепочечные (+)-цепи, включающиеся в новые вирусные частицы. По такому же принципу происходит Репликация РНК-содержащих вирусов и фагов. Т. о., во всех известных случаях Репликация ДНК и РНК проходит через стадию двухцепочечных молекул.

У высших организмов — эукариотов, клетки которых содержат сформированное ядро, основную генетическую функцию несут сложно организованные структуры — хромосомы, состоящие из ДНК, РНК, белков и других веществ. В интерфазе, предшествующей делению клеток (см. Митоз, Мейоз), осуществляется Репликация ДНК и других компонентов хромосом; затем удвоенные хромосомы разъединяются и распределяются равномерно между дочерними клетками. Т. о., вся наследственная информация в относительно неизмененном виде передаётся от клетки к клетке, от поколения к поколению.

Хеликаза, топоизомераза и ДНК-связывающие белки расплетают ДНК, удерживают матрицу в разведённом состоянии и вращают молекулу ДНК. Правильность репликации обеспечивается точным соответствием комплементарных пар оснований и активностью ДНК-полимеразы, способной распознать и исправить ошибку. Репликация у эукариот осуществляется несколькими разными ДНК-полимеразами. Далее происходит закручивание синтезированных молекул по принципу суперспирализации и дальнейшей компактизации ДНК. Синтез энергозатратный.

Цепи молекулы ДНК расходятся, образую репликационную вилку, и каждая из них становится матрицей, на которой синтезируется новая комплементарная цепь. В результате образуются две новые двуспиральные молекулы ДНК, идентичные родительской молекуле.

Каждая молекула ДНК состоит из одной цепи исходной родительской молекулы и одной вновь синтезированной цепи. Такой механизм репликации называется полуконсервативным. В настоящее время этот механизм считается доказанным благодаря опытам Мэтью Мезельсона и Франклина Сталя (1958 г.). Ранее существовали и две другие модели: «консервативная» — в результате репликации одна молекула ДНК состоит только из родительских цепей, а другая — только из дочерних цепей; «дисперсионная» — все получившиеся в результате репликации молекулы ДНК состоят из цепей, одни участки которых вновь синтезированы, а другие взяты из родительской молекулы ДНК).

Процесс редупликации: раскручивание спирали молекулы - отделение одной цепи от другой на части молекулы ДНК - воздействие фермента ДНК-полимеразы на молекулу - присоединение к каждой цепи ДНК комплементарных нуклеотидов - образование двух молекул ДНК из одной. (3)

Этапы репликации

Репликация проходит в три этапа:

1. инициация репликации

2. элонгация

3. терминация репликации.

А) Репликация начинается с инициации.

Инициация репликации может начаться только в подготовленном к ней ядре клетки. И первое условие, которое необходимо выполнить - это подготовить мономеры, из которых будут собираться новые молекулы ДНК на родительских молекулах-матрицах. Мономерами будут служить активированные с помощью фосфорилирования свободные нуклеотиды - дезоксирибонуклеотидтрифосфаты. Это ближайшие родственники так хорошо знакомой нам АТФ, они тоже трифосфаты, богатые энергией, но только вместо рибозы у них дезоксирибоза. И кстати, рибонуклеотидтрифосфаты, включающие в свои ряды АТФ, тоже понадобятся для репликации.

Теперь надо определить, с какого именно места начать дублирование ДНК, т.е. репликацию. Ошибаются те, кто думает, что инициация начинается от начала молекулы ДНК, но ошибаются также и те, кто думает, что она начинается с конца. На самом деле инициация начинается с множества точек, раскиданных по всей длине молекулы ДНК. Таких "запальных точек" может быть 5-50 на одну молекулу ДНК.

Итак, инициация начинается с появления репликативной точки. Эта точка отмечена на ДНК специфической последовательностью нуклеотидов, богатой парами А-Т. Именно к ней присоединяется по несколько молекул специальных распознающих белков, которые обеспечивают последующее присоединение ферментного комплекса и таким образом запускают процесс репликации. Важно отметить, что на репликативную точку садятся сразу два одинаковых ферментных комплекса, обеспечивающих репликацию. От точки посадки они расползаются в противоположные стороны по двойной спирали ДНК. Каждый комплекс при этом реплицирует сразу обе родительские цепи ДНК и выдаёт на выходе вместо двух цепей - четыре.

ДНК-реплицирующий комплекс включает в себя около 20 компонентов. Отметим главные из них.

Геликаза (хеликаза) расплетает ДНК на две отдельные цепи. Образуется репликативная вилка. По-видимому, при этом данный участок расплетённой ДНК отделяется от хромосомных белков. На разъединение комплементарной связи в каждой паре нуклеотидов тратится энергия 2-х молекул АТФ.

Молекула ДНК жестко закреплена в некоторых учакстках на ядерном матриксе и поэтому не может свободно вращаться при расплетании. Это блокирует продвижение геликазы по цепи.

Топоизомераза надрывает одну из двух нитей ДНК, и она раскручивается вокруг целой нити. Так снимается структурное напряжение при раскручивании спирали. Затем разорванные концы сращиваются обратно тем же ферментом. У бактерий другой вид топоизомеразы (гираза) разрывает сразу обе цепи ДНК, а после раскручивания спирали соединяет их вновь. Надо сказать, что в этом случае бактерии действуют более эффективно, чем человек вместе со всеми остальными эукариотами!

В одной репликативной вилке действуют две геликазы, которые движутся в противоположных направлениях. Разделенные цепи фиксируются ДНК- связывающими белками. Участки формирования репликативной вилки называются «точками ori» (origin - начало). У эукариот одновременно образуется тысячи таких вилок, что обеспечивает высокую скорость репликации. (4)

Б) Элонгация ДНК происходит неодинаково для двух ее цепей. ДНК- полимераза III прокариот и δ- или α-ДНК-полимеразы эукариот осуществ- ляют синтез лишь в направлении 5’>3’. Цепь с такой направленностью -- лидирующая.

ДНК-полимераза III или δ-полимераза непрерывно присоединяют к ней комплементарные нуклеотиды. Цепь с полярностью 3’>5’ является отстающей и достраивается по частям (также в направлении 5’>3’). α-ДНК-полимераза (или ДНК-полимераза III) синтезирует на этом цепи короткие участки - фрагменты Оказаки. Синтез фрагментов Оказаки и лидирующей цепи начинается с образования РНК-праймеров (затравок) длиной 10-15 рибонуклеотидов ферментом праймазой (РНК-полимеразой). Ни одна из ДНК- полимераз не способна начать синтез ДНК с нуля, а может лишь достраивать существующую цепь. Параллельно с образованием лидирующей цепи или фрагментов Оказаки происходит удаление рибонуклеотидов из праймеров и замена их нуклеотидами ДНК (при участием β-ДНК-полимеразы, которая имеет как экзонуклеазную, так и полимеразную активность). (5)

В) Терминация и расхождение в кольцевых геномах. Замкнутость структуры многих геномных ДНК упрощает завершение репликации всей нуклеотидной последовательности. Непрерывный рост лидирующей и отстающей цепей вдоль кольцевой матрицы неизбежно приводит к совмещению 3'-гидрокси - и 5'-фосфорильного концов одной цепи либо в точке начала репликации, либо - при двунаправленной репликации - в середине кольца. Кольца в этих местах встречи соединяются ДНК-лигазой, при этом обычно они оказываются попарно сцепленными, и в дальнейшем должно произойти их разъединение на отдельные геномы. Это происходит с помощью топоизомеразы типа II.

Терминация и завершение репликации в линейных ДНК. За исключением репликации аденовирусной ДНК, где синтез новых цепей ДНК инициируется белковым праймером и матричная цепь копируется полностью, во всех других случаях для репликации необходим РНК-праймер, что создает особые проблемы при завершении репликации линейной дуплексной ДНК. Дело в том, что после инициации синтеза новой цепи и последующего удаления РНК-праймера новосинтезированная цепь содержит пробел на 5'-конце. Поскольку никаких способов удлинения 5'-концов цепей ДНК не существует, необходимы какие-то иные методы завершения репликации.

Были предложены два способа, с помощью которых процесс репликации мог бы завершаться. Один из них предполагает, что существуют цепи ДНК с прямыми повторами на концах. После репликации два комплементарных конца обоих незавершенных дуплексов могут спариться и образовать линейные конкатемеры с одноцепочечными разрывами. Остающиеся пробелы могут быть заполнены путем удлинения цепей в направлении 3'->5' с последующим соединением их ДНК-лигазой либо путем прямого соединения стыкующихся концов с помощью ДНК-лигазы с образованием конкатемеров. После надрезания конкатемера специфической эндонуклеазой образуются выступающие 5'-концы, и ДНК-полимераза может наращивать более короткие цепи с 3'-конца.

Другой способ предполагает наличие на конце каждой цепи ДНК коротких инвертированных повторов, благодаря которым образуются небольшие петли.3'-конец петли служит праймером для копирования нереплицированного участка. Благодаря специфическому разрыву в начале инвертированного повтора получается структура, которую можно достроить с 3-конца до восстановления исходной двухцепочечной концевой последовательности.

Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что концевые области эукариотических хромосом - теломеры - реплицируются с помощью особого механизма, отличного от представленных выше. Концы хромосом дрожжей, беспозвоночных, растений и позвоночных имеют сходное, весьма необычное строение: они содержат шпилькообразные структуры, в которых 3' - и 5'-концы дуплекса ДНК оказываются рядом, и много коротких тандемных повторов. Около петли в одной из цепей в области повторов имеются множественные одноцепочечные разрывы. Вопрос о том, как подобная структурная организация может способствовать репликации концов дуплексных участков, выясняется. Если учесть сходство структурных особенностей конечных областей хромосом, то можно предположить, что механизм репликации всех эукариотических хромосом одинаков. (6)

Поиск по сайту: