Генетика. На модели бактерий и вирусов были открыты все основные закономерности генетики

На модели бактерий и вирусов были открыты все основные закономерности генетики.

1.Особенности морфологической организации ядерного аппарата бактерий: - не имеет ядерной мембраны, ядрышка, носит название нуклеоид;

- носителем генетической информации является ДНК. Если у эукариот ДНК-линейная, то у большинства бактерий - кольцевая, и одна нить фиксирована на цитоплазматической мембране. Если раскрутить ДНК,то длина будет в сотни раз превышать длину клетки. ДНК бактерий суперспирализована.

- бактериальная клетка содержит одну хромосому, т.е. бактерии являются гаплоидными организми.

2. Биохимические особенности.

- ДНК бактерий имеет тот же состав, что и ДНК эукариот;

- у бактерий в составе ДНК могут находиться минорные основания, наличие которых защищают ДНК от действия собственных эндонуклеаз, которые бактерии выделяют в большом количестве;

- в геноме патогенных бактерий имеются участки ДНК, которые отличаются от основного генома составом Г-Ц пар нуклеотидных оснований. Эти участки ответственны за синтез факторов патогенности-острова патогенности;

- ДНК бактерий не содержит гистонов, а их роль выполнят полиамины.

Бактериальный геном представлен структурами, которые способны к автономной репликации. Таких структур две: хромосомы, в которых закодирована вся жизненно необходимая информация (в хромосоме бактерий содержится до 3 тыс. различных генов), и плазмиды.

Плазмиды - это ДНК, которые имеют кольцевую природу. В самых крупных плазмидах содержится не более 200 генов. Плазмиды в клетке могут находиться в одном из двух альтернативных состояний: в свободном или интегрированном с хромосомой.

В плазмидах закодирована дополнительная генетическая информация, которая не является жизненно необходимой для клетки, но наличие этой информации сообщает ей определенные селективные преимущества. В одной клетке может находиться много плазмид, они подразделяются на группы несовместимости. В состав плазмид входят:

-структурные гены;

-гены, отвечающие за собственную репликацию плазмиды.

Некоторые плазмиды имеют гены, обеспечивающие трансмиссивность плазмиды - tra-гены.

По кодируемому признаку различают:

- R плазмиды- кодируют лекарственную устойчивость бактерий;

- F (sex) плазмиды - определяют способность клетки быть донором генетической информации;

- Col плазмида - кодирует синтез бактериоцинов. Это вещества белковой природы, которые губительно действуют на близкородственные виды бактерий, при этом для самой клетки, продуцирующей эти вещества, их синтез является губительным, но обеспечивает выживание популяции в целом;

- плазмиды, отвечающие за синтез факторов вирулентности (Ent-, Hly-)

и другие плазмиды.

В состав бактериального генома входят подвижные генетические элементы:

IS-элементы (insertion sequences), транспозоны и интегроны. Они обнаружены как в составе бактериальной хромосомы, так и в составе плазмид. Их репликация – составная часть репликации хромосомы и плазмиды.

IS-элементы - короткие (2000) нуклеотидные последовательности. Отличительной особенностью IS-элементов является наличие на концах инвертированных повторов, которые узнает транспозаза. Они не несут структурных генов; одинаковы у бактерий разных видов, родов, и даже считается, что они одинаковы у прокариот и у эукариот. IS-элементы могут перемещаться как по хромосоме, так и между хромосомами. Они содержат 2 гена:1-й кодирует синтез транспозазы; этот фермент обеспечивает процесс исключения IS элемента из хромосомы и его интеграцию в новой локус хромосомы. 2-й ген кодирует синтез репрессора, который регулирует весь процесс перемещения.

Транспозоны – это сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-элемент, но имеющие структурные гены.

Интегроны – подвижные генетические элементы; они содержат ген, кодирующий устойчивость к антибиотикам. Интегроны являются системой захвата малых элементов ДНК, называемых генными кассетами посредством сайтспецифической рекомбинации и их экспрессии.

Значение мобильных элементов.

Перемещаясь по ДНК клетки или между ДНК, они вызывают:

- инактивацию генов тех участков ДНК, куда они переместившись встраиваются;

- повреждения генетического материала;

- встраивание плазмиды в хромосому;

- распространение гена в популяции бактерий.

Бактериям как и всем живым существам свойственна изменчивость. Изменчивость у эукариот происходит по вертикали, у бактерий – и по вертикали, и по горизонтали.

Различают два вида изменчивости:

- фенотипическая и

-генотипическая.

Фенотипическая изменчивость проявляется в виде модификаций - это изменение свойств клетки под влиянием внешних воздействий.

Модификации могут быть длительными и кратковременными. Модификационные изменения касаются подавляющего большинства клеток популяции.

Генотипическая - это мутации или рекомбинации.

Мутации могут быть спонтанными и индуцированными.

Рекомбинация у бактерий рассматриваются как аналоги полового размножения.

Рекомбинации - это взаимодействие между двумя геномами, обладающими различными генотипами, которое приводит к образованию генома, сочетающего гены донора и реципиента. В процессе рекомбинации бактерий условно делят на клетки-доноры, которые передают генетический материал, и клетки-реципиенты, которые его принимают.

Особенности рекомбинаций у бактерий:

- отсутствует мейоз. Образуется не зигота, а меразигота.

- всегда направлена от донора к реципиенту.

- количество генетического материала у реципиента всегда больше одного.

Рекомбинант содержит всю генетическую информацию реципиента и часть генетической информации донора.

У эукариот механизм рекомбинации один – мейоз; у бактерий различают три вида рекомбинаций:

1) трансформация- это обмен генетической информации с помощью чистой ДНК.

При трансформации передаются незначительное количество информации. В популяции бактерий всегда одни бактерии разрушаются и поэтому присутствует чистая ДНК. Но:

- реципиент должен находиться в состоянии компетентности, т.е. он готов пропустить этот фрагмент;

- попавший в клетку фрагмент ДНК, чтобы встроиться в ДНК реципиента должен обладать комплементарностью.

2) трансдукция – этот способ переноса генетической информации с помощью фагов.

3) конъюгация – это способ передачи генетической информации, когда между двумя бактериями образуются цитоплазмические мостики. При конъюгации в клетку-реципиент может перейти почти весь геном.

Метод конъюгации используется при составлении генетической карты бактерий.

Через определенный промежуток времени процесс конъюгации прерывается, и определяют, какой признак передался в клетку-реципиент. Генетическая карта бактерий представляется в виде циферблата на котором расположены гены, которые кодируют тот или иной признак.

Генетические методы применяются в практических целях как для обнаружения микроба в исследуемом материале без выделения чистой культуры, так и для определения таксономического положения микроба и проведения внутривидовой идентификации.

Секвенирование генома – определение последовательности пар нуклеотидов ДНК. Применяется для определения вида и штамма бактерий. Является единственным методом типирования вирусов и определения их устойчивости к химиотерапевтическим препаратам.

Рестрикционный анализ – этот метод основан на применении ферментов рестриктаз – это эндонуклеазы, которые расщепляют молекулу ДНК только в определённых местах. У бактерий к настоящему времени выделяют более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты (участки) узнавания (рестрикции). Если выделенную из конкретного материала ДНК обработать определенной рестриктазой, то это приведет к образованию строго определенного количества фрагментов ДНК фиксированных размеров. Эти фрагменты определяются при электрофорезе в агарозном геле.

Риботипирование – позволяет определить вид бактерий. Последовательность нуклеотидных оснований в оперонах, кодирующих рРНК, характеризуется наличием как консервативных участков, которые имеют сходное строение у различных бактерий, так и вариабельных последовательностей, которые родо- и видоспецифичны и являются маркерами при генетической идентификации. Фрагменты ДНК, которые после обработки ее рестриктазами, содержат последовательности генов рРНК. Эти гены могут быть обнаружены методом молекулярной гибридизации с меченой рРНК соответствующего вида бактерий.

Молекулярная гибридизация – применяется в геносистематике. Этот метод позволяет выявить степень сходства различных ДНК. При t= 90℅ ДНК расплетается на две нити. Каждую нить фиксируем на специальном фильтре, после чего вносим в раствор, содержащий ДНК-зонд – это одноцепочечная молекула ДНК, меченная. Если они комплементарны, то образуется двойная спираль.

ПЦР – целью является обнаружение генов или соответствующих нуклеотидных последовательностей, кодирующих либо видовую принадлежность, либо иной признак.

Метод ПЦР основан на принципе комплементарности и позволяет увеличивать (амплифицировать) количество исследуемого образца ДНК. Этот метод обладает чрезвычайно высокой чувствительностью и теоретически позволяет обнаружить в исследуемом материале даже единичные молекулы ДНК.

Практическая чувствительность этого метода =1*10², время – 3-6 часов.

Компоненты ПЦР:

- исходная ДНК

- праймеры – это синтетические олигонуклеотиды состоящие из 15-30 нуклеотидов, комплементарных сайтам на идентифицируемой матрице ДНК.

- Tag-полимераза – это термостабильная ДНК – полимераза. Оптимум её действия отмечается при температуре равной 72 градусам. Она способна удлинять праймеры и присоединять их к 3¢ концу дезоксинуклеотидтрифосфаты при условии, что праймер комплементарен сайту цепи матричной ДНК. Наращивание длины прймера будет до тех пор, пока не будет достроен участок до 5¢ конца. Tag-полимераза высоко стабильна и сохраняет свою активность до конца цикла амплификации, поэтому вводится в реакционную смесь один раз.

- смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов – они являются строительным материалом, используемым Tag – полимеразой для строительства второй цепи ДНК.

ПЦР – протекает автоматически в программируемом термостате, который носит название – термоциклер или амплификатор.

Разработана различная аппаратура для учета результатов ПЦР.

Каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий, которые протекают при различной температуре. Продолжительность одного цикла 3 минуты. За 3-6 часов можно получить до 50 млрд. копий исходной ДНК.

- денатурация м – ДНК, t=95⁰С;

- отжиг праймеров, t=60⁰С;

- удлинение стартового участка ДНК.

Во время первой стадии происходит плавление м – ДНК при температуре 95⁰С. При этом нити ДНК разделяются и становятся доступными для праймеров.

Во второй стадии в пробирку вносим праймеры, а смесь охлаждается до 60⁰С. Праймеры при внесении в исследуемую пробу работают подобно паре генетических «детективов», которые «прочесывают» этот раствор в поисках участка, к которому они присоединяются. Потом создаются короткие двунитевые участки. Без этих участков дальнейшее удлинение невозможно.

Затем вступает в действие Tag – полимераза, она осуществляет удлинение участка посредством присоединения к реакционной смеси коротких нуклеотидов по принципу комплементарности. Удлинение начинается с праймеров. В результате копируется только определенный фрагмент молекулы ДНК. Точно в такой же последовательности проходят второй и последующие циклы. При этом каждый цикл удваивает число копий. Один цикл длится не более 3 минут. За 3-6 часов можно получить до 50 млрд. копий.

ПЦР может быть отнесена к экспрессивным методам диагностики.

Разновидности ПЦР:

- ПЦР в режиме реального времени; даёт возможность определить количество фрагментов ДНК находящегося в материале, т.е. проводить количественный анализ;

- мультиплексная ПЦР – преимущество заключается в том, что в реакционную смесь можно вводить 2 – 4 и более пары праймеров. Они характерны для различных возбудителей. С её помощью проводят быструю диагностику, например, атипичных пневмоний.

- обратнотранскрипционная ПЦР – позволяет осуществить копирование РНК возбудителей, для чего в реакционную смесь вводится фермент ревертаза или обратная транскриптаза.

С помощью ПЦР определяются только нуклеотидные последовательности, кодирующие определенный признак, но нельзя сказать, присутствуют ли микроорганизмы в материале в живом состоянии, поэтому ПЦР не является альтернативой бактериологическому исследованию.

Область применения ПЦР:

- для диагностики особо опасных инфекций;

- при хронических инфекциях, возбудители которых персистируют в организме;

- для обнаружения некультивируемых форм бактерий;

- для обнаружения антибиотикорезистентности у медленно растущих бактерий

- для идентификации бактерий в ходе бактериологического исследования;

- для обнаружения микроорганизмов, которые медленно или совсем не растут на питательных средах;

- в медицинской практике ПЦР широко применяется для диагностики наследственных и онкологических заболеваний, для типирования тканей.

ДНК – чипы являются новейшими технологиями гибридизационных методов молекулярно-генетического анализа. Они представляют собой носители известных олигонуклеотидов (менее 20 оснований каждый), комлементарных участкам исследуемого генома (или геномов) и занимающих определенный сайт (ячейку). Плотность посадки таких нуклеотидных минифрагментов может быть очень высокой (до нескольких десятков тысяч на квадратный сантиметр). При наличии в исследуемой пробе фрагментов искомой ДНК они гибридизуются (соединяются по принципу комплементарности) с нуклеотидными последовательностями, сидящими на чипе. В качестве носителя может выступать стекло, нейлон и др. Чип – стеклянная пластинка, на которую нанесены тысячи площадок в виде ямок из геля, в которые вносят капельки пробы. В каждой ямке содержатся молекулы-зонды, способные вылавливать из раствора соответствующие молекулы. Зонды – это или фрагменты ДНК, или определенные белки.

Классификация бактерий.

Основной таксономической единицей у бактерий является вид. Для обозначения вида у бактерий используется двойная (бинарная) номенклатура

Вид у бактерий- это совокупность родственных бактерий, которые обладают сходными биологическими свойствами и имеют общее происхождение. В настоящее время существует 3 подхода к классификации бактерий:

1. Рутинная классификация.

Она лежит в основе определителя бактерий под редакцией Берджи. Принцип: Все бактерии делятся на большие группы; в основу деления положены:

- форма;

- наличие споры;

- отношение бактерий к окраске по Граму;

- тип получения энергии.

Кажд.гр.→семейство→род→вид. Это деление осуществляется по биохимическим свойствам бактерий. Внутри вида возможна дальнейшая дифференциация на ферментовары, фаговары, колициновары, серовары и серогруппы, резистовары, биовары.

2. Геносистематика.

- определение молярного процентного содержания Г-Ц пар в молекуле ДНК;

- определение нуклеотидных последовательностей в молекуле ДНК;

- молекулярная гибридизация.

3. Нумерическая таксономия.

Поиск по сайту: