Подсчет и анализ лейкоцитарной формулы

Определение лейкоцитарной формулы

Цель: Подсчитать лейкоцитарную формулу (процентное соотношение различных видов лейкоцитов) в окрашенных мазках крови.

Приготовление мазков: На сухое обезжиренное предметное стекло ближе к короткой стороне наносят небольшую каплю крови стеклянной палочкой или непосредственно из места укола пальца и оставляют стекло в горизонтальном положении. Шлифовальное стекло, которым будет сделан мазок, ставят на предметное под углом 30 – 45° на 1 – 2 мм перед каплей крови и движут назад так, чтобы оно коснулось крови и капля распространилась по всему короткому ребру шлифовального стекла. Затем быстрым движением вперед вдоль стекла делают мазок.

Мазки высушивают на воздухе и маркируют. Высохший мазок должен быть равномерно тонким слоем, желтоватого цвета, занимать около ¾ общей длины стекла и заканчиваться «метелочкой».

Фиксация. Фиксация мазков необходима, чтобы впоследствии клетки не претерпели каких-либо морфологических изменений и чтобы предотвратить повреждение мазка при дальнейшем окрашивании.

Фиксируют мазки в метаноле (или в 75 %-м этаноле) в течение 5 минут, а затем высушивают на воздухе. Фиксированные мазки окрашивают любым классическим способом (по Романовскому – Гимзе, Май – Грюнвальду и т.д.).

Окраска по Романовскому – Гимзе. Краситель Романовского – Гимзы состоит из щелочной и кислой частей. Щелочная часть – азур II, а кислая часть – эозин. Азур II окрашивает в ярко-синий цвет, эозин – в розово-красный.

Приготовление растворов. Чтобы приготовить основной раствор красителя, растворяют 30 г азура II – эозина и 0,8 г азура II (или 3,8 г сухой красящей смеси Гимзы) в 250 мл глицерина, нагревая при этом 90 – 120 мин при 560 С, а затем прибавляют 250 мл метилового спирта. В настоящее время чаще всего используют готовый краситель Романовского-Гимзы, из которого перед началом работы готовят раствор из расчета: 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды.

Ход окраски: высохший фиксированный мазок помещают в кювету с рабочим раствором краски на 25 – 40 минут (время окраски устанавливают опытным путем для каждой новой партии красителя).

Результат окраски: Ядра клеток – красно-фиолетовые. Эозинофильные гранулы красновато – коричневые, базофильные – синие, нейтрофильные – фиолетовые. Цитоплазма лимфоцитов голубая, иногда с нежными азурными гранулами красного цвета. Эритроциты бледно – красноватого цвета. Тромбоциты имеют более светлую, синюю наружную часть и фиолетовую внутреннюю.

Дифференциальный подсчет лейкоцитарной формулы.

Реактивы: Иммерсионное масло, Диэтиловый эфир.

Специальное оборудование: Микроскоп, 11-клавишный счетчик для подсчета лейкоцитарной формулы.

Ход исследования: с помощью объектива 10 Х (малого увеличения) находят край мазка крови. Наносят каплю иммерсионного масла и, не меняя положения стекла, переводят иммерсионный объектив (90 Х) таким образом, чтобы он погрузился в каплю масла. Подбирают с помощью микровинта соответствующее фокусное расстояние, устанавливая четкую видимость клеток. Приступают к дифференцированию лейкоцитов, отмечают клетки с помощью 11 – клавишного счетчика; необходимо просчитать не менее 200 лейкоцитов. Подсчет лейкоцитов проводят, соблюдая следующее правило: отступив 2 – 3 поля зрения от края мазка, затем 3 – 5 полей зрения вдоль края мазка, затем 3 – 5 полей зрения под прямым углом по направлению к середине мазка, снова 3 – 5 полей зрения параллельно краю, затем под прямым углом по направлению к краю и т.д.; таким образом, стекло двигают по зигзагу (линия «меандра»). Просчитав около половины клеток на одном краю мазка, меняют положение стекла и другую половину клеток считают на противоположном крае.

При исследовании лейкоцитарной формулы необходимо дифференцировать неразрушенные лейкоциты.

Нейтрофилы имеют бледно-розовую цитоплазму с нейтрофильными гранулами, окрашивающимися в розово-фиолетовый цвет. Форма ядра нейтрофилов зависит от их зрелости. Палочкоядерные нейтрофилы, являющиеся более молодыми клетками, имеют ядро в виде изогнутой палочки. У зрелых нейтрофилов ядро вследствие перекручивания разделено на ряд сегментов, связанных очень тонкими, иногда почти незаметными нитями. Это полиморфноядерные, или сегментоядерные, нейтрофилы.

У эозинофилов и базофилов цитоплазма окрашена очень слабо. Эозинофилы имеют ярко окрашенные красные гранулы, окрашивающиеся эозином. Ядро эозинофилов по структуре близко к ядру нейтрофилов: более молодые клетки имеют палочковидное ядро, более зрелые – сегментированное. Однако сегментация ядра выражена меньше. Ввиду относительной малочисленности эозинофилов учет палочкоядерных и сегментоядерных форм в отдельности не производится. Базофилы в цитоплазме содержат крупные темные фиолетовые или ультрамариновые гранулы, часто закрывающие отдельные участки ядра. Ядро базофилов неправильной формы, окрашивается в фиолетово-розовый цвет.

Лимфоциты и моноциты, составляющие группу агранулоцитов, не содержат зернистости в цитоплазме. Клетки лимфоцитов округлые, с круглым или овальным ядром, которое окружено или очень узким (малые лимфоциты), или более широким (средние и большие лимфоциты) пояском цитоплазмы. Цитоплазма лимфоцитов голубая. Часто она видна лишь с одной стороны от ядра (в виде серпа). В некоторых клетках и этот серп незаметен, и тогда малый лимфоцит имеет вид «голого ядра». Моноциты крупнее лимфоцитов, большей частью круглой, иногда неправильной формы, с хорошо выраженной цитоплазмой. Цитоплазма моноцитов серо-голубая. Ядро сравнительно велико и имеет выступы и углубления. Обычно оно «бобовидной» формы. Интенсивность окраски ядра моноцитов слабее, чем лимфоцитов.

Анализ полученных данных и общий вывод:

В учебной практике по клеточной биологии были получены навыки приготовления цитологических препаратов с использованием методов, соответствующие поставленным задачам исследования.

При исследовании мазков крови лягушки и человека было выявлено ряд отличительных черт, т.е проведен сравнительный анализ. Рисунки приведены в альбоме.

В дальнейшем с помощью различных биофизических аппаратов было проведено ознакомление с различными анализами крови, в ходе которых были получены следующие данные:

Агрегометрические параметры крови на приборе агрометр MA-1: в статическом режиме – 03,2; в динамическом – 05,8

Данные с биохемилюминесцентного анализа с помощью биохемилюминометра БХЛ-3606М: 33244 squr

Эти полученные данные являются нормальными показателями для крови здорового человека, что в дальнейшем было подтверждено спектрофлуориметрическому анализу на Shimadzu RF-5301.

Затем было произведено исследование 100 лейкоцитов, где было идентифицирован каждый лейкоцит и подсчитано количество лейкоцитов в каждом классе. Полученные результаты выражены в процентном количестве лейкоцитов каждого типа среди всех лейкоцитов крови:

· базофилы – 1%

· эозинофилы – 4%

· миелоциты – 2%

· палочкоядерные – 4%

· сегментоядерные – 49%

· лимфоциты – 40%

Можно заметить, что данные попадают в промежуток колебаний количества лейкоцитов у здорового человека, что свидетельствует о нормальном функционировании кровеносной системы человека.

Таким образом, в ходе учебной практики были закреплены, углублены теоретические знания, а также приобретены необходимые практические умения и навыки в области дисциплины «Клеточная биология».

Список литературы:

1. Верещагина В. А. Основы общей цитологии: Учебное пособие для студентов высш. учеб.заведений /В. А. Верещагина. – М.: Издательский центр «Академия», 2007.

2. Студеникина Т. М. Гистология, цитология и эмбриология: учебное пособие М.: НИЦ ИНФРА-М; Мн.: Нов.знание, 2013.

3. Данилов Р. К. Гистология. Эмбриология. Цитология: Учебник для студентов медицинских вузов / Р. К. Данилов – М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2006.

4. Ченцов, Ю.С. Введение в клеточную биологию: Учебник для вузов /Ю.С.Ченцов. – М.: ИКЦ «Академкнига», 2004.

5. Афанасьев Ю.И. Гистология, цитология и эмбриология; под ред. Ю. И. Афанасьева, Н. А. Юриной. – 5-е изд., перераб. и доп.. – М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2012. –

6. Семенова, Н.Д. Техника гистологических исследований: практикум /Н.Д. -Семенова. – Воронеж, 2005.

Поиск по сайту: