АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

Различия микробиологических и химических вредных факторов в пище

Читайте также:
  1. VIII. Описание основных факторов риска, связанных с деятельностью Общества
  2. Алфавитный указатель вредных веществ в питьевой воде, приведенных в приложении 2
  3. Алфавитный указатель вредных веществ в питьевой воде, приведенных в приложении 2
  4. Анализ влияния факторов на косвенные расходы
  5. Анализ опасных факторов и разработка контрольных и предупреждающих действий.
  6. Анализ показателей оплаты труда и влияющих на них факторов. Документация для анализа использования фонда оплаты труда.
  7. Анализ потенциально вредных факторов производственной среды.
  8. Анализ факторов внутренней и внешней среды организации.
  9. Анализ факторов и резервов увеличения выпуска и реализации продукции
  10. Анализ факторов изменения объема реализации продукции
  11. Анализ факторов развития отрасли за 3-5 последних лет
  12. АНАЛИЗ ФАКТОРОВ РИСКА МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В КРИТИЧЕСКИХ ТОЧКАХ КОНТРОЛЯ В РЫБОПЕРЕРАБАТЫВАЮЩЕЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

 

Микробиологические Химические
Число микробов может увеличиваться, реже уменьшаться по ходу пищевой це­пи Значимых изменений в содержании! контаминантов нет
Однократное воздействие оказывает вред Необходимо многократное воздей- 1 ствие
Нет кумуляции Кумулятивный эффект
Разнообразие реакций организма на один и тот же микробный агент Специфический эффект
Четкая зависимость реакции от состоя­ния восприимчивого организма (возраст, иммунный статус и т.д.); отсутствие ли­нейной зависимости от количества мик­робов Зависимость от дозы контаминанта носит линейный характер

В целом AMP — это научно-аналитический процесс в об­щем контексте анализа рисков, когда вероятность и масштаб вредных последствий для отдельного человека, группы лиц или населения в целом, употребляющих продукты источ­ники вреда, вычисляются математически путем интеграции данных, полученных в биологии и медицине, с данными из области сельского хозяйства, переработки, статистики. Он служит новым средством научно-обоснованной оценки как факторов риска, связанных с пищей, так и мер, которые будут предприниматься для их минимизации или ликвидации. Ос­новным здесь является понятие самого микробиологического риска, т.е. функции вероятности наступления отрицательного эффекта для здоровья и величины этого эффекта, как следст­вия вредного фактора (микроба, микробного токсина), при­сутствующего в продукте. Из определения ясно, что риск мо­жет быть двояким:


Приложение 1. Анализ микробиологического риска в гигиене питания 233

— риск загрязнения пищевого продукта микробными факторами;

— риск инфицирования и его неблагоприятных последст­вий для потребителей — заболеваемости, осложнений, смертности.

Структурная схема AMP подчиняется общим принципам концепции анализа рисков и состоит из 3-х элементов: (1) оценки микробиологического риска (ОМР) с 4-мя подэлемен-тами — как собственно научного процесса, (2) управления рисками как звена политических и практических действий, (3) коммуникаций по рискам — интерактивного обмена ин­формацией и мнениями среди всех заинтересованных. Со­гласно CCFH, процесс AMP инициируется государственными органами, хотя заявить о нем может любая из заинтересован­ных сторон — участников оборота и потребления пищевых продуктов. Он начинается с формулирования проблемы (про­филя риска), несущей существенную угрозу для здоровья.

Чтобы обеспечить правильность вопросов, на которые бу­дет отвечать ОМР, профиль риска должен быть максимально детализирован. Исходя из цели AMP — снизить воздействие на население опасных микробных факторов с пищей, на этом этапе необходимо четко обосновать связь конкретных патоге­нов с основными источниками их поступления — определен­ными видами пищевых продуктов, и с факторами, при кото­рых эти патогены будут концентрироваться именно в них. Для этого следует собрать сведения о заболеваемости опреде­ленной инфекцией и её последствиях, убытках, связанных с загрязнением продукта её возбудителем, проблемах в торгов­ле и экономике, и связать их с объемами производства и по­требления, ресурсами и технологиями, регламентами и спосо­бами контроля. Риск-менеджерами Комиссии «Кодекс Али-ментариус» заявлено об оценках для 24-х наиболее важных в международной торговле патогенов-возбудителей пищевых инфекций, из которых 22 комбинации «Патоген — продукт» находятся в разных стадиях разработки и 2 — в стадии фор­мулировки профиля (табл. 2).




Микробиологические основы ХАССП...


Приложение 1. Анализ микробиологического риска в гигиене питания 235


 


Таблица 2


Варианты качественных оценок риска


 


                       
   
   
     
 
 
 
 
   
 
   
 

Примеры комбинаций «Патоген— продукт»для ОМР

Бактерия рода Salmonella

Куриные яйца

Бактерии рода Salmonella

Мясо цыплят-бройлеров

Продукты, готовые к употреблению (мясные деликатесы, паштеты, рыба .______________ холодного копчения

Listeria monocytogenes

Campylobacter spp.

Мясо цыплят-бройлеров

Bacillus cerens

Пюре из капусты-брокколи

Escherichia coli 0-157 ине-0-157

Мясные полуфабрикаты из говядины

Escherichia coli 0157 и не-0-157

Пророщенные семена

Vibrio parahaemolyticus

Живые устрицы

Vibrio parahaemolyticus

Рыба морская fit-fish
Детские сухие смеси
Ente

Enterobacter sakazakii

Первым условием ОМР является системность подхода: чтобы охарактеризовать риск, связанный с присутствием микробов в пище, их распространенность и концентрация в продуктах должны оцениваться на каждом этапе пищевой цепи, от сырья до конечного потребления, для получения объ­ективных итоговых величин нагрузки и понимания, в каком звене происходит основное накопление возбудителя.

Так как характеристики риска должны быть исчерпы­вающими, а принятые в итоге решения — абсолютно согласо­ванными, второе условие — мультидисциплинарность AMP и участие в её выполнении всех заинтересованных сторон. Это позволит обеспечить доступ к материалам, первичным дан­ным и консультациям от разных ведомств, а также знаниям в специальных областях.

По прошествии 10 лет с начала работы над ОМР стало яс­но, что разные типы проблем требуют разных типов оценки: качественных (или «консервативных», «грубых») и количе­ственных (прогнозных, вероятностных). Качественная оценка является описательным или сравнительным способом обра­ботки информации и преимущественно используется для оценки риска загрязненности пищевых продуктов вредными факторами микробной природы; при проведении экспертиз позволяет как минимум ранжировать и выделять риски в ка­тегории, например, как показано ниже.


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  II III
Высокий Оценка относительно какого-либо извест­ного уровня воздей­ствия Простая оценка конеч­ного результата (напри­мер, «среднее число» или «наихудший слу­чай»)
Средний
Низкий
Больше, чем
Меньше, чем
По регионам, сезонам и т.п.

Этот способ очень полезен, так как может быть проведен быстро, что ускоряет решение специфических проблем, или наоборот, показывает, что по конкретному вопросу нет необ­ходимости детальных количественных оценок воздействия.

Количественные оценки — это математический анализ числовых данных во всех подэлементах ОМР, предпринимае­мый как для характеристики вреда, так и его неблагоприят­ных последствий для потребителей. В свою очередь они под­разделяются на 2 категории (детерминистические и стохасти­ческие), в основе которых лежат принципы используемых расчетов. Категория детерминистических ОМР базируется только на фактических цифровых величинах (Мсс, min, max) и позволяет получить простую усредненную оценку или наи­худший вариант ожидаемого риска. Эти оценки также назы­вают прямыми или точечными.

Стохастические (или пробабилистические от англ. «probability») ОМР основаны на вероятностном распределе­нии. В качестве вводных здесь используются величины, поня­тия и параметры, которые в готовом виде отсутствуют, но мо­гут быть получены путем моделирования, основанного на знании закономерностей развития микроорганизмов. Данный подход отличается от прямого тем, что учитывает во всех по­дэлементах ОМР такие важные характеристики как изменчи­вость и неопределенность.

Изменчивость присуща любым биологическим системам (микробам, высшим организмам) как способность к приспо­соблению. При проведении оценки риска это главный подле­жащий учету и измерению атрибут, в котором заключается отличие микробиологического вреда от химического.




Микробиологические основы ХАССП...


Приложение 1. Анализ микробиологического риска в гигиене питания


 


Неопределенность возникает из-за недостатка знаний о явлениях и невозможности их получения современными средствами; как правило, относится к информации, которая нужна для оценки, но недоступна, и поэтому она должна быть постулирована или выведена. Для её получения и использу­ются математические и статистические модели, они позволя­ют снизить неопределенность.

Стохастический подход позволяет дать оценку распро­странению риска и характеризовать его степень для разных популяций населения. Эта сторона количественных оценок полезна тем, что дает перспективные направления развития как в области науки и производства, так и в совершенствова­нии мер профилактики пищевых заболеваний.

Поэтому ОМР пригодна не только для решения сущест­вующих проблем (например, сальмонеллезов от куриных яиц). Этот подход может быть использован и как заранее изу­чающий возможную причину неблагоприятного воздействия на здоровье и прогнозирующий ожидаемый риск. Уже пред­принимаются такие оценки риска, как ГММ в продуктах ферментации или ОМР продуктов, полученных путем техно­логий нетермического консервирования.

В контексте AMP сугубо важным является распростране­ние информации о риске. Этот процесс — не только взаимо­действие между органами, отвечающими за меры по устране­нию риска, специалистами по ОМР, изготовителями, науч­ными работниками и т. д. Обязательными здесь являются от­крытость и доведение до потребителей результатов прини­маемых решений, в том числе через СМИ. Учитывая специ­фику этой стороны процесса, для осуществления деятельно­сти по ОМР и AMP должны создаваться специальные органы, кооптирующие на абсолютно легальной основе специалистов и представителей всех заинтересованных сторон. Следует от­метить, что в РФ органы для ОХР аккредитованы на базе службы Роспотребнадзора, находящейся в ведении Мин-здравсоцразвития, в отличие от большинства зарубежных стран, где они далеки от медицины, а медики привлекаются лишь для получения нужной информации. Это несомненное преимущество, поскольку повышение безопасности пищевых продуктов и снижение рисков заболеваний от пищи в России


всегда являлось одной из главных задач профилактического звена здравоохранения. Кроме того, именно в РФ знания в области структуры питания и потребления продуктов изна­чально являются предметом медицинской науки, и уже потом органов статистики.

Соответственно, ближайшей задачей для России является организация деятельности по ОМР, направленная на сниже­ние этих рисков по наиболее актуальным для страны направ­лениям. Ими могут быть бактерии рода Shigella в продуктах из пастеризованного молока, бактерии рода Salmonella в кре-мово-кондитерских изделиях, энтеропатогенные E.coli в про­дуктах общественного питания. В ГУ НИИ питания РАМН уже проводится работа по оценке нагрузки населения некото­рыми микробными контаминантами с пищей. Продукты мас­сового потребления изучаются с точки зрения получения ко­личественных характеристик обсемененности. Так, взяв за основу данные о средних уровнях содержания КОЕ энтеробак-терий в 1 г продукта и о фактическом среднедушевом потреб­лении, мы рассчитали, какое их количество может погло­щаться человеком в сутки с наиболее значимыми продуктами в рационе (табл. 3).

Таблица 3

Расчетные величины суточного поступления E.coli и колиформ с пищей в

ЖКТ взрослых людей — КОЕ в порции (Мер) (данные по среднесуточному

потреблению в РФ за 2002 год)

 

Продукт Размер порции в день, г E.coli колиформы
Молочные продукты из пасте­ризованного молока, в т.ч. молоко пастеризованное 820 290 2,17x10s 7,0x10" 3,38x10я 5,8x10'
Кисломолочные продукты (на­питки, творог, сметана); сыры; масло сливочное   2,1x10" 2,8x10я
[Колбасы вареные   1,8х10! 3,7x10я
|Сырокопченые мясопродукты   10г 3x10'
[Салаты порционные   9,4x10' 1,9x10s
ЦКремово-кондитерские изделия   4,5x10' 7,4x10*
|итого - 2,2x10* 3,4x10"

               
   
   
       
 
 
 

 

Микробиологические основы ХАССП...

Из данного примера простой оценки по варианту «среднее число» видно, что основными источниками БГКП и E.coli яв­ляются пастеризованное молоко и кисломолочные продукты традиционной технологии. Суммарная расчетная нагрузка колиформами (без учета частоты загрязненности) на взрослых потребителей с ежедневно потребляемыми молочными про­дуктами из пастеризованного молока составляет 3,38х108 КОЕ. Это в 590 раз превышает расчетный уровень их потреб­ления с продуктами, которые соответствуют гигиеническим требованиям по данному показателю (5,74х105 КОЕ), и на 3-6 логарифмических порядков — с продуктами других групп.

Результатом процесса AMP является разработка мер для устранения опасности, суть которых зависит от масштабов охарактеризованного риска. Безусловно, основными являют­ся официальные регламенты. — нормативы, стандарты на продукцию. Они вводятся, если риск высокий и устранить его только санитарными мероприятиями на производстве невоз­можно. К другим мерам, при соблюдении которых можно обеспечить надлежащий уровень защиты и снизить или уст­ранить риск загрязненности, относятся рекомендации про­мышленности, торговле, потребителям, в том числе по па­раметрам технологии. Относительно новым средством можно назвать и целевые установки, например, сроки снижения за­болеваемости путем целенаправленной деятельности во всех звеньях общественной и хозяйственной деятельности на го­сударственном уровне. Так, для осуществления задачи сни­жения заболеваемости пищевым листериозом в 2 раза к 2010 г., поставленной в США в 2000 г., было принято решение о ревизии внутренних систем контроля качества, их замене на ХАССП с поэтапным за 6 лег его внедрением на всех пищевых предприятиях страны, без исключения.

К настоящему времени для двух наиболее существенных в международной торговле возбудителей пищевых инфекций (Salmonella spp. в яйцах и птице и L.monocytogenes в продук­тах, готовых к употреблению) анализ риска завершен. ССГН представил для разработки два новых профиля: по ЕНЕС в про­ращенных злаках и мясных полуфабрикатах, а также E.saka-zakii в детских сухих смесях, поскольку уже очевиден высокий уровень опасности этих пищевых патогенов в разных странах.


Приложение 1, Анал из микробиологического риска в гигиене питания 239

Следует акцентировать, что нельзя смешивать понятия AMP и ХАССП, один из этапов внедрения которого посвящен выявлению и оценке рисков на производстве. Этот этап в ХАССП — практическая задача, призванная обеспечить вы­пуск доброкачественной продукции на конкретном предпри­ятии в конкретных условиях, тогда как AMP генерирует ин­формацию, которая служит обоснованием всех элементов борьбы с опасными факторами в данном виде продукта как такового.

Методология процесса ОМР. Структурная схема ОМР представлена на рис. 1. Надо отметить, что при общих проце­дурных подходах с ОХР, действия в процессе ОМР имеют чет­кую специфику на каждом из этапов, а именно:

1 этап. Идентификация опасного фактора (вреда).

Цель этапа — идентифицировать микроб (или микробный токсин), способный отрицательно влиять на здоровье при его наличии в продукте или группе продуктов. Сбор научных и практических данных, подтверждающие значимость этой комбинации. Одним из ключевых вопросов этапа является разработка генеральной структурной схемы пищевой цепи продукта (модульной модели процесса риска — ММПР).

Микробиологические факторы потенциально нестабиль­ны: они способны размножаться или отмирать, изменять ха­рактеристики патогенности во время определенных стадий производства и хранения. Поэтому учет возможных влияний на них определяет результат всей процедуры анализа. Соот­ветственно, ММПР должна отразить точки, где это происхо­дит, и помочь оценить поведение микробов на каждом этапе пищевой цепи от фермы до стола потребителя. В неё может быть включено от 1 до 6 основных фундаментальных событий, которые могут оказывать влияние на динамику любого мик­робного вреда в любом пищевом процессе: рост и размноже­ние, инактивация, порционирование, смешивание, удаление и перекрестная контаминация.

Эти события способны влиять на величины ключевых вводных для оценки воздействия: частоту загрязненности (3„) и концентрацию микробов (К„) в продукте. Самым существен­ным из них является смешивание (измельчение, помол, ку­паж и т.п.), которое увеличивает оба показателя.



Микробиологические основы ХАССП...


Приложение 1. Анализ микробиологического риска а гигиене питания 241


 


Этапы

I

Идентифи­кация вред­ности (микробов, токсинов)

II

Оценка воздействия

(нагрузки вредностью)

III

Характери­стика вреда


Вопросы, которые должны быть решены в ходе этапа

О г-

i Какие агенты за­грязняют пищу и ока­зывают ли они отри­цательный эффект на здоровье потребителей?

? Сколько потении ально опасного продук та потребляется

?Как факторы в пище­вом продукте влияют на количество патоге­нов и вирулентность

У Какова частота и уровни патогенов в оп­ределенном количестве пищи в момент потреб ления

? Какова природа не­благоприятных эффек­тов от употребления микроорганизмов с пи­щей

? Каково взаимодейст­вие «ДОЗА - ОТВЕТ»


Действия

- скрининг патогенов в продуктах;

- сбор научных и практиче­ских данных и профиль риска;

- построение структурной схемы пищевой цепи продукта

 

- научные исследования, математическое моде­лирование;

- анализ информации изготовителей, надзор­ных и статистических органов

 

- научные исследования, математическое моде­лирование;

- анализ эпидемиологиче­ской и клинической ин­ формации


Начало воздействия опасного фактора в модульной схеме может выбираться от любого этапа пищевой цепи, в зависимо­сти от целей оценки. Пример упрощенной диаграммы приве­ден на рис. 2.

Модульная модель процесса риска для веротоксинпродуцирующих E.coli в

мясных полуфабрикатах: стадии продвижения продукта и факторы,

влияющие на микробы

Промежуточная

•*■ ■*-

Варка, жарение (Факторы: ингибиция, перекрестная контаминация)
Убой (Фактор - фекальная контаминация туш VT-E.coli)
т

Зачистка Размораживание (Факторы - удаление, размножение или ингибиция)

Процесс транспортировки (Фактор; размножение)
Потребление: Параметры: размер порции=150 г

Обвалка

Нарезка

Измельчение

Порционирование:

(Фактор - смешивание)

ВОЗДЕЙСТВИЕ

Рис.2


 


           
 
   
 
 
   

IV Характери­стика риска
Математические и стати­стические расчеты

• Какова вероятность и степень тяжести неблагоприятных эф­фектов, которые име­ют место или могут произойти в данной популяции при упот­реблении загрязненного

Рис. 1. Процедура оценки микробиологического риска


2 этап. Оценка воздействия (ОВ) — это определение веро­ятности и степени нагрузки отдельных групп населения или населения в целом опасным микробным фактором с продук­том. Суть процесса — получение информации о количествах патогенов или их токсинов, поглощенных потребителем, и частоте случаев такого потребления.

Здесь должны быть две группы вводных — объемы по­требления потенциально опасного продукта и величина его контаминации исключительно в момент потребления. Пер­вая не отличается в принципе от ОХР и может быть получена из достоверных источников путем учета потребляемых про-



Микробиологические основы ХАССП...


Приложение 1. Анализ микробиологического риска в гигиене питания



 


дуктов в неделю, месяц, в один прием пищи, т. е. с порцией. Вторая группа имеет выраженные особенности. Так, надо по­лучить данные об исходном размере контаминации сырого материала и полуфабрикатов (с учетом сезонности, регио­нальных различий, эпизоотологической информации) и про­гнозировать влияние на неё предполагаемых технологий, хранения, транспортировки, кулинарной подготовки. Затем надо установить изменение контаминации в продукте на эта­пах пищевой цепи. Кроме того, необходимо рассчитать два или более варианта ОВ, где учесть нормальные условия и предполагаемые нарушения.

На данном этапе нужно углубляться в конкретные меха­низмы влияний на микробную загрязненность, чтобы просчи­тать их эффект. В табл. 4 показано, какие показатели бакте­риальных коитаминантов и пищевых продуктов необходимо использовать для этих целей.

Таблица 4

Обязательная информация для расчета поведения микробиоты на этапах пищевой цепи

скорость роста;

Характеристики микробов

- lag-фаза;

максимальный уровень популяции;

Физико-химические ха­рактеристики продукта

- взаимодействие с другими микробами

- температура (термообработка, холод);
рН;

-А,;

-консерванты _____________________

Очевидно, что это колоссальный массив информации, чтобы его получить в научных исследованиях, необходимо очень большое время. Чтобы не задерживать принятие мер по ограничению риска, AMP допускает возможность использо­вания практических материалов, характеризующих загряз­ненность, которые не были целенаправленно получены для ОМР, но накоплены промышленностью и надзорными орга­нами при расследовании вспышек. Поскольку эти сведения почти не несут количественной информации и часто несопос-


тавимы, их надо трансформировать и скомбинировать перед использованием. Однако недостаток или некорректность ко­личественных данных, представленных для оценки, — основная проблема ОМР, вплоть до отказа от некоторых из них (табл. 5).

Таблица 5 Практические данные, используемые ОМР и их недостатки

за пищевыми

Данные мониторинга продуктами
Внутренние материалы изготовителей
Материалы потребительских органи­ заций______________________________

— результаты выражены не в КОЕ, a i граммах и см3 продукта, где опре­делялась отсутствие-присутствие микроба;

— собраны в разное время;

— разные системы отбора проб;

разные методы анализа

Данные расследований вспышек

В связи с этим принципом ОМР стало использование до­пущений и предположений, как при обработке имеющихся данных, так и при заполнении «пустот» путем предсказы­вающего моделирования поведения микробов с учетом раз­личных параметров. Предсказывающие модели используют математические выражения для описания изменений бакте­риальных чисел от времени и окружающих условий. Конст­руирование моделей — развивающийся процесс. Сегодня описаны и апробированы модели различных категорий с раз­ной степенью чувствительности к факторам среды и точности. Софистические на основе математических расчетов и принци­па итеграции (первичные — Пуассон, p-pert, треугольного распределения; вторичные — р-, у- и Вайбулл), а также тре­тичные — программно-обеспеченные комплекты и эксперт­ные системы типа Монте-Карло. Чтобы улучшить точность количественных оценок, все больше предпочтения отдается сложным методам имитационного моделирования — таким, как Монте-Карло.

В любом случае ОВ должна дать заключение о финальной его точке, генерируя расчеты вероятности и размеров нагруз­ки микробной вредностью, формируя ступень для следующих стадий оценки риска — характеристики вреда и характери­стики риска.


               
 
   
   
 
   
 
   

 

Микробиологические основы ХАССП...

3 этап. При характеристике фактора вреда ОМР должна снова преодолеть ряд неопределенностей и вариабельности, но уже связанных с человеком. Известно, что ответ человеческой популяции на возбудителей пищевых токсикоинфекций вы­соко вариабелен, и зависит от интеграции эффектов организ­ма-реципиента (возраста, состояния иммунитета, питания и т. д.), патогена (вирулентности, количества проглоченных клеток) и пищевой матрицы, воздействующей на патоген.

Индивидуумов, которые заболевают, глотая низкую дозу, называют восприимчивыми. Они обычно включают детей, пожилых, беременных, лиц со сниженным иммунитетом. В то же время, от низких доз могут заболевать и здоровые взрос­лые. Иными словами, не может быть абсолютно безопасного порога, вернее, даже самое малое количество возбудителя способно генерировать определенные неблагоприятные эф­фекты. По этой причине идеология ОМР полностью изменила сложившиеся в гигиене питания подходы. Ответ на дозу по­глощенных с пищей микробов теперь необходимо характери­зовать не в виде порога минимальной инфицирующей дозы возбудителя, а как показатель вероятности и тяжести инфек­ции. Задача ОМР — просчитать, как часто и в какой форме инфекция возникнет в данной популяции от возбудителя, контаминирующего продукт.

Поэтому, поскольку из стадии ОВ уже ясно, сколько мик­робов будет поглощено человеком с пищей, 3-я ступень ОМР должна количественно оценить их поведение в организме и определить характеристики возможных патологических ис­ходов в ответ на воздействие разных доз. Сугубо необходимо измерить влияние тех физиологических барьеров, с которыми возбудитель сталкивается первыми и которые могут быть оп­ределяющими для развития инфекции: кислотность желудка, факторы желчи, локального иммунитета (лизоцим, slgA, ин­терферон) и др. Например, одним из таких параметров будет число микробных клеток (по отношению к проглоченному), поступивших в нужный сайт в ЖКТ, где проявляется их дей­ствие, а также прикрепившихся к нему. Или учет числа лю­дей в популяции, употребивших с конкретным продуктом конкретную дозу патогена, у которых он вызвал либо инфи­цирование, либо манифестацию болезни.


Приложение 1. Анализ микробиологического риска в гигиене, питания 245

Для этих целей в ОМР используются результаты экспе­риментального и математического моделирования, исследо­ваний на животных и эмпирических наблюдений за людьми-добровольцами, анализа реальных вспышек заболеваний от пищи.

Для выявления зависимости «Доза микроба— отрица­тельный эффект» необходимо, как минимум, выбрать крите­рии этого эффекта (биологические конечные точки), а также прогнозировать механизмы патогенности. О последних из­вестно, что пищевые заболевания микробной природы реали­зуются в виде трех проявлений — инфекции, токсикоинфек­ций, интоксикации. Поэтому важно рассчитать, по какому пути пойдет процесс при вариабельности обоих живых объек­тов, таких, как патоген и макроорганизм.

Примеры биологических конечных точек для патогенных энтеробактерий приведены в табл. 6.

Таблица 6

Виды биологических ответов на патогены, поглощенные с пищей

 

Эффект Критерий для учета Конечный результат расчета
Инфицирование Колонизация кишечника Число больных и носителей в группе населения
Заболеваемость Клинические проявления болезни Число заболевших и степень тяжести болезни в группе на­селения
Смертность Летальные исходы в резуль­тате болезни Количество умерших от ин­фекции
Частота тяже­лых форм и инвалидности Специфические осложнения (гемато-уринарный син­дром, реактивный артрит) Количество лиц среди забо­левших, у которых развились осложнения

Чтобы связать патологические ответы у потребителей с микробами, присутствующими в пище, у последних в процес­се ОМР в обязательном порядке должно быть подтверждено наличие вирулентных характеристик (токсигенности, факто­ров адгезии, супрессии иммунитета хозяина и т.п.). Эти свой­ства желательно оценивать не только биологическими мето­дами, но и путем поиска вирулентных генов и определения факторов, влияющих на их экспрессию.



Микробиологические основы ХАССП...


Приложение 1, Анализ микробиологического риска в гигиене питания 247


 


Такие свойства патогенов, как кислотоустойчивость и способность разрушать факторы локального иммунитета, должны оцениваться количественно. В силу микробной из­менчивости они резко возросли у вновь возникших патогенов и наряду с другими факторами патогенности стали опреде­ляющими для развития инфекции. В последние годы в рабо­тах по ОМР показано, что поведение и количество выживших в желудке клеток может быть определено при использовании моделей in vitro, имитирующих условия в ЖКТ у человека («механистических» по терминологии оценщиков риска). Од­нако варианты моделей, описанные в литературе очень редко использовались для экспериментальной оценки выживаемо­сти и вирулентности возбудителей пищевых инфекций, не всегда были приспособлены для этого, так как в основном соз­давались для изучения атакуемости белков и других пищевых веществ ферментами пищеварительного тракта.

Ранее нами была предложена модель, имитирующая про­цесс пищеварения в желудке и проксимальном отделе кишеч­ника, предназначенная первоначально для прогнозирования поведения in vitro различных микроорганизмов в ЖКТ в норме и при патологии. Моделировались такие параметры, как ки­слотность желудочного и дуоденального сока, их ферментные компоненты, скорость физиологических сокращений и темпе­ратурные условия, время пребывания и возможное защитное действие пищи у детей 1-го года жизни и взрослых. Модель успешно использовалась для обоснования величин нормативов для условно-патогенных микроорганизмов в детских и диети­ческих продуктах, а также для изучения выживаемости мик-роорганизмов-пробиотиков после прохождения «желудка» и усовершенствования рекомендаций по их приему.

В то же время, надежных механистических моделей «До­за — ответ» до сих пор в мире очень мало. Признается, что идеальной будет являться многосекционная модель, которая позволяла бы оценивать для патогена последовательно такие атрибуты, как:

— степень кислотной инактивации в желудке;

— способность размножаться в кишечнике;

— % прикрепления к клеткам эпителия кишечного трак­та;


— расчет вероятности поведения микроба в организмах с раз­личным уровнем иммунитета. Для данной ступени ОМР имеет значение еще одна осо­бенность, установленная в последнее время; концентрация возбудителя в продукте в момент потребления, хотя и безус­ловно важна, но строго не влияет на частоту и тяжесть заболе­ваний от пищи. Конечно, высокие уровни патогенов генери­руют заболевания в большем проценте популяции, и это осо­бенно четко проявляется в группах риска. Просчитано, что категория населения со сниженным иммунитетом даже в раз­витых странах составляет 20%, но внутри этого сегмента есть также различные по восприимчивости группы. Поэтому для оценки риска «малых» доз возбудителя сугубо важной явля­ется достоверная информация о факторах хозяина. Накопле­ние базы данных о параметрах состояния здоровья, которые играют ведущую роль при пищевых инфекциях, в том числе показателях локального и клеточного иммунитета, кишечно­го микробиоценоза у людей разных возрастов, рас, питания, на сегодняшний день, насущная задача для прогресса AMP,

Данные о потенциальной опасности пищевых патогенов, полученные в прошлые годы в эмпирических опытах на здо­ровых взрослых добровольцах, как правило, не могут быть интерпретированы сегодня с позиций ОМР. Причина в том, что эти модели не отражают различий в человеческой попу­ляции в плане генетического фона, питания, возраста, имму­нитета, уровней стресса и др. Коме того, они не могут исполь­зоваться в случаях агрессивных возбудителей. То же отно­сится к результатам исследований in vivo с заражением лабо­раторных животных — здесь наряду с трудностями в экстра­поляции данных на людей, большая часть информации про­сто непригодна, так как была получена в моделях паренте­рального (внутрибрюшинкого), а не естественного пути поступления в ЖКТ.

В этой связи ОМР остро нуждается в полноценной «риск-ориентированной» эпидемиологической информации о со­стоянии пищевой заболеваемости в разных группах населе­ния. При ее сборе должны учитываться сведения: о возбуди­теле (наличие факторов патогенности, концентрация в 1 г за­раженного продукта); о заболевших (возраст, состояние здо-



Микробиологические основы ХАССП...


Приложение 1, Анализ микробиологического риска е гигиене питания 249


 


ровья, число пострадавших из числа подвергавшихся риску); о тяжести заболеваний; о путях инфицирования продуктов. Эти сведения могут стать едва ли не самыми полезными, по­скольку будут отражать реальную ситуацию.

Также требуют изучения и факторы пищевого продукта, поскольку они могут в определенных случаях прямо влиять на экспрессию вирулентности возбудителей. Например, гемоли­тическая активность у L.monocytogenes четко повышается в присутствии белков крови и мышечной ткани убойного скота.

В общем, стадия характеристики вреда, предназначенная для измерения биологического ответа, самый сложный и пока недостаточно разработанный этап во всей ОМР.

4 этап. Заключительной стадией ОМР является разработ­ка характеристики риска как интеграции оценки воздейст­вия и характеристики вреда для прогнозирования вероятно­сти наступления и тяжести известных или потенциальных отрицательных эффектов конкретного патогена на здоровье конкретных категорий населения. На четвертом этапе для получения детализированной характеристики риска интегри­руются и фактические данные, и данные модельных расчетов. При этом признано, что характеристики, которые включают влияние как можно большего количества различных факто­ров на пути продукта к потребителю, обеспечивают и более эффективные меры управления риском.

Но окончании ОМР формулируется стратегия действий по устранению или снижению риска и после экспертизы переда­ется менеджерам по риску. Принимая во внимание изначаль­но заложенные в характеристики вреда изменчивость и неоп­ределенность, наличие в оценках показателей, полученных путем сложного имитационного моделирования, и учитывая, что задачи в плане мер по устранению риска будут адресованы людям, некомпетентным в этих вопросах, ФАО/ВОЗ, чтобы не вызывать непонимания и недоверия, рекомендует разрабаты­вать как минимум две версии ОМР: (1) содержащую все тех­нические детали и (2) понятную широкой аудитории, вклю­чающую доступное изложение характера неопределенностей и оценки.

Обобщая вышеописанное, совершенно определенно мож­но сформулировать преимущества AMP для гигиены питания,


которые предопределяют необходимость его внедрения в сис­тему контроля безопасности пищевых продуктов на совре­менном этапе:

1. AMP — это универсальная структурная модель для про­изводства более безопасной пищи, уменьшения количест­ва связанных с нею инфекций и устранения препятствий во внутренней и международной торговле.

2. Требования микробиологической безопасности продук­тов, которые отвечают стандартам, разработанным на ос­нове анализа рисков, считаются соответствующими со­глашению СФС ВТО, т.е. гармонизированными.

3. Результаты характеристики риска способствуют разра­ботке и внедрению научно-обоснованных, а значит и наи­более объективных и реалистических регламентов, норм, кодов практики и санитарных правил. Способность AMP прогнозировать тяжесть и последствия опасности, явля­ется убедительным преимуществом по сравнению с тра­диционными мерами управления микробным рисками, так как позволяет рационализировать ресурсы при осу­ществлении мер защиты населения.

 

4. Обеспечивает более целостный подход к безопасности пищи путем интеграции рисков по пищевой цепи и при­влечения для его разработки всех её участников. Это осо­бенно актуально в России, где до сих пор есть разный уро­вень ответственности участников оборота.

5. Допускает до окончания работы разрабатывать промежу­точные меры управления риском, чтобы количественная ОМР не была тормозом для принятия решений. Одновре­менно это фокусирует всех, заинтересованных на иссле­дованиях по расшифровке неопределенностей, на разра­ботке новых стратегий контроля или профилактики.

ЛИТЕРАТУРА

Государственные стандарты США и России. ХАССП. М.: ВНИИС, 2002.593 с.

Benford D. Principles of risk assessment of food a. drinking water related to human health, ILSI Europe Concise Monograph se­ries.2001, ISBN 1-57881-124-4, Brussel, 34 p.



Микробиологические основы ХАССП...


 


Discussion paper on the risk profile for enterohaemorrhagic E.eoli including the identification of the commodities of concern, including sprouts, ground beef a. pork. Codex Alimentarius Commission, CX/FH 04/10 — Add.2, Washington, 2004, 33 p. European commission. Health&consumer protection directorate-general. Risk assessment of food borne bacterial pathogens: quantitative methodology relevant for human exposure assess­ment.. //Preliminary report, 21-22 February 2002, 81 p. FAO/WHO, Geneva, 2004. (Microbiological Risk Assessment series, No.6 ISBN: 92 4 156262 5). Enterobacter sakazakii and other ml-croorganisms in powdered infant formula MRA 00/06: WHO/FAO guidelines on hazard characterization for pathogens in food and water - WHO / FAO / RIVM Workshop on Hazard Characterization. FAO / WHO, 2000. CD-ROM, ISBN 92-5-104550-X. Principles a. Guidelines for the Conduct of MRA/

ftp://ftp.fao.org/codex/standard/en/CXG_030.epdf. Proposed draft principles a. guidelines for the conduct of microbiological risk management (at step 3 of the procedure). CX/FH 04/6, January 2004, Materials of 36"1 Session CCFH, Washington, 2004, 15 p. Report of the AD HOC expert consultation on risk assessment of microbiological Hazards in Foods: related matters. EX/FH 01/5-Add.3, Rome. 2001 Report of the Consultation of the FAO/WHO Expert Committee "Safety assessment of food derived from genetically modified microorgan­isms", Geneva, 24-28.09, 2001, 40 p. Report of the Joint FAO/WHO Expert Consultation on Risk Assessment of Microbiological Hazards in Foods. FAO. Rome. 17-21 July 2000, 47 p. Risk assessment of Salmonella in eggs a. Broiler chickens. Microbiological risk assessment series No.2, WHO / FAO, Rome, 2002, 302 p, Schlundt J. Specific Issues in Microbiological Risk Assessment./Food safety — application of risk assessment, ILSI Europe, working document. Russ. Ministry of Science a. Technology, RAMS. Mos­cow. 2000. P. 136-145. Stringer M. Food-Safety Objectives — Role in microbiological Food Safety Management. ILSI Europe Report Series. Marseille, 2004. P. 3-36. The Interaction between Assessors a. Managers of Microbiological Haz­ards in Food. Report of a WHO Expert Consultation, Kiel, 21-23 March, 2000. 23 p.


Приложение 2

ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРОБНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ГОТОВЫХ ПРОДУКТОВ, СЫРЬЯ, ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ОБОРУДОВАНИЯ И ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Основные вопросы, на которые необходимо ответить при осуществлении микробиологического контроля, могут быть сформулированы следующим образом:

Есть ли в образце что-либо из жизнеспособных микроор­ганизмов (скрининговый анализ)?

Если есть, то, в каком количестве и что (подтверждающие идентификационные тесты)?

Существующие сегодня базовые методы выявления, под­счета и идентификации микроорганизмов, в основном, бази­руются на выращивании и выделении микроорганизмов на плотных питательных средах на основе агар-агара.

Эти методы представляют собой рутинные операции, дос­тупные любой микробиологической лаборатории. Они позво­ляют стандартизовать процедуры исследований и добиться высокой воспроизводимости результатов. Они являются об­щепризнанными в санитарной микробиологии и практически во всех областях, регулирующих вопросы биобезопасности.

Однако развитие общества и промышленности предъяв­ляет новые требования к микробиологическим методам ис­следований, используемым в производстве и в социальной сфере.

Недостатки существующих методов.

1. Длительность исследований. Исследования занимают дни или даже недели. Например, согласно требованиям ГФ XI срок инкубирования после посева на агаровые питательные среды составляет 7 суток. В United States Pharmacopeia (USP) 23 издания (1995г.) для образцов, полученных методом мем­бранной фильтрации, требовался 7-дневный срок инкубиро­вания, который затем был продлен до 14 дней. Аналогичные изменения произошли в European Pharmacopeia при замене 3-го издания (1997) на 4-е (1998). Увеличение срока наблюдения было связано с тем, что при более коротком времени инкуби-



Микробиологические основы ХАССП...


Приложение 2. Экспресс методы обнаружения и идентификации... _____________ 253


 


рования не обнаруживались «медленнорастущие» микроор­ганизмы. При этом некоторые исследователи полагают, что необходимо увеличение времени инкубации, по крайней мере, до ЗОдней.

Для некоторых биогехнологических продуктов время проведения микробиологического анализа фармакопейными методами может превышать срок их годности.

2. Ограничения, связанные с выделением жизнеспособ­ных микроорганизмов. Многие микроорганизмы плохо растут на искусственных питательных средах, после того, как они были лишены богатой, естественной питательной среды или обработаны консервантами, дезинфицирующими средствами, высокой температурой или газами дезактивации.

3. Ограниченная возможность идентификаций микроор­ганизмов. Во многих случаях, индивидуальные микроорга­низмы не могут быть изолированы из-за сливающегося роста колоний и требуют дополнительных пересевов на новые ага­ровые среды, что существенно увеличивает время их иденти­фикации, если таковое вообще возможно.

4. Целесообразность применения существующих микро­биологических методов исследования к отдельным биотехно­логическим продуктам. Некоторые продукты имеют настоль­ко высокую себестоимость и производятся в столь малых объ­емах, что стоимость проведения анализа фармакопейным ме­тодом будет очень высока.

Современная микробиологическая лаборатория нуждает­ся в разработке и внедрении новых инновационных подходов и методов исследования, связанных с обнаружением, иденти­фикацией и подсчетом микроорганизмов в продуктах пита­ния, окружающей среде и производственном процессе. Эти методы должны учитывать особенности исследуемых образ­цов и технологических процессов, условия транспортировки готовых продуктов, их хранения и дальнейшего использова­ния.

Требования, которым должны соответствовать современ­ные методы идентификации и подсчета микроорганизмов, можно разделить на технологические и эксплутационные, а также требования, связанные с признанием новых методов государственными структурами, регулирующими и контро-


лирующими вопросы санитарии, биологической безопасности потребительских продуктов и их производства (валидацион-ные требования).

Технические требования:

1. Значительно сокращение времени исследований по сравнению с существующими микробиологическими метода­ми.

2. Увеличение чувствительности, точности и воспроизво­димости результатов исследований.

3. Возможность обнаружения мизерного количества жиз­неспособных микроорганизмов без предварительного накопи­тельного культивирования.

4. Возможность определения и идентификации широкого спектра микроорганизмов в процессе одного исследования.

5. Возможность автоматизировать исследования на базе оборудования с высокой производительностью.

Технологические требования:

1. Эти методы должны быть достаточно просты и доступ­ны в использовании.

2. Затраты, связанные с внедрением новых методов, не должны существенно превышать текущих затрат, или быть компенсированы за счет экономического эффекта от внедре­ния.

Экономический эффект может быть достигнут за счет:

— возможности оперативного управления технологиче­скими процессами;

— экономии средств за счет снижения брака;

— улучшения качества выпускаемой продукции, в том числе, и за счет снижения доли консервантов в готовом продукте;

— оптимизации затрат, связанных с поддержанием на должном уровне чистоты (стерильности) процессов;

— снижения товарных остатков на складе с неаттестован-ной продукцией.


               
   
     
 
   
 
   
 
 

 

Микробиологические основы ХАССП...

Валидационные требования:

1. Результаты исследований, полученные с помощью но­вых методов, должны быть сопоставимы с результатами, по­лученными с помощью существующих методов. В первую очередь это связано с проблемой скорейшей ратификации но­вых методов и их внедрения в практику. Как бы ни заманчиво было использование новых экспресс-методов взамен сущест­вующих методик, прежде всего следует доказать правомоч­ность их использования.

2. Современные методы определения и идентификации микроорганизмов по своим основным характеристикам: об­щее время исследований; специфичность метода; чувстви­тельность — должны превосходить существующие методы.

В настоящее время существует огромная потребность во внедрении быстрых микробиологических методов на различ­ных стадиях производства:

— исследования на стерильность и пределы микробной обсеменённости готовых и промежуточных продуктов, сырья, оборудования, помещений, воздуха, воды, тех­нологических газов, персонала и т.д.;

— предстерилизационная оценка микробной загрязнен­ности для выбора оптимальных режимов стерилиза­ции;

— оценка эффективности санитарной обработки и процес­сов стерилизации;

— контроль процессов ферментации микробных и кле­точных культур;

— испытания на определение эндотоксинов;

— расследование инцидентов микробного загрязнения.

Во всех этих случаях эффективность микробиологическо­го контроля во многом будет определяться временем проведе­ния исследований, и, как следствие, временем выбора управ­ляющих воздействий.

Новые методы, позволяющие сократить время исследова­ний, принято называть «экспресс-методами». Точного и об­щепринятого определения «экспресс-методов» в микробиоло­гических исследованиях не существует. Как правило, к ним относят все методы выявления и идентификации микроорга­низмов, позволяющие сократить время исследований, или


Приложение 2. Экспресс методы обнаружения и идентификации... _____________ 255

автоматизировать труд лаборанта с помощью аппаратурных комплексов.

Экспресс-методы внедряются производителями в основ­ном на добровольной основе. Внедрение новых методов обна­ружения и идентификации микроорганизмов помогает ре­шать на производстве задачи, связанные с управлением каче­ством готовой продукции на предприятии, пониманием и управлением технологическими процессами в целом. Затраты и эксплутационные расходы, связанные с внедрением этих методов, окупаются достаточно быстро. Однако необходи­мость дублирования исследований с помощью методов, при­знанных регулирующими органами, сдерживает их широкое применение и, как следствие, является тормозом в развитии целого направления в микробиологии.

Для решения проблем, связанных с валидацией экспресс-методов, американские и европейские Фармакопеи уже пред­ложили общие главы по быстрым микробиологическим мето­дам. Признавая необходимость всесторонней валидации лю­бого метода, рассматриваемого как альтернатива фармако­пейному, и учитывая отсутствие главы, в которой широко рассматривались бы валидационные требования, но примени­тельно к микробиологическим методам, Экспертный комитет USP по аналитической микробиологии приступил к разра­ботке новой общей информационной главы «Валидация Аль­тернативных Микробиологических Методов», Эту работу предваряла публикация Технического отчета №33 «Оценка, валидация и внедрение новых методов микробиологического анализа», подготовленного Ассоциацией производителей па­рентеральных препаратов (PDA). В Европе так же подготов­лен проект общей фармакопейной статьи Европейской фар­макопеи, рассматривающий использование альтернативных микробиологических экспресс-методов.

Очень важно понимать, как в зарубежных Фармакопеях трактуется понятие «соответствия фармакопейным требова­ниям». В этом плане очень важен следующий абзац из Общих глав USP 25<61: «Каждый поступающий в реализацию фар­макопейный препарат (вещество) должен быть произведен таким образом, чтобы при проведении анализов и тестов в со­ответствии с фармакопейной статьей он отвечал всем требова-



Микробиологические основы ХАССП...


Приложение 2. Экспресс методы обнаружения и идентификации... _____________ 257


 


ниям описывающей его статьи. Однако, из этого не следует, что полный анализ образцов из каждой производственной се­рии перед ее выпуском является необходимым условием обес­печения фармакопейным стандартам».

Более полная трактовка данной формулировки дается в статье «Подготовка информационной главы USP для демон­страции эквивалентности микробиологических методов», написанной Д. Э. Кнаппом — Председателем Экспертного комитета USP по аналитической микробиологии, С.И.У.Сат-тоном — Вице-председателем Экспертного комитета USP по аналитической микробиологии, Р. Дабба — Директором USP по комплексной деятельности и Д. А. Портером — Предста­вителем Экспертного комитета USP по аналитической мик­робиологии по связям с научной общественностью: «Важным в этом абзаце является то, что любой фармакопейный про­дукт должен соответствовать фармакопейным требованиям при анализе фармакопейными методами, но такой анализ не является обязательным для каждой производственной се­рии. Другими словами, главное назначение фармакопейных методов не заключается в том, чтобы быть выпускными. Важно, чтобы при проверке любого включенного в USP про­дукта включенными в статью методами он соответствовал всем ее требованиям.

В этой цитате содержаться утверждения, которые следует выделить.

1. Не обязательно делать полный анализ каждой произ­водственной серии перед выпуском.

2. Для анализа препарата могут использоваться не толь­ко фармакопейные методы.

3. Производитель должен гарантировать, что выпущен­ный им фармакопейный продукт будет соответствовать фар­макопейным требованиям при анализе фармакопейными ме­тодами.

В общей главе USP 25 содержится точка зрения фармако­пеи на вопрос альтернативных методов: «Возможно также определение соответствия путем использования альтернатив­ных методов, выбираемых по соображениям правильности, чувствительности, точности, избирательности, возможности автоматизации или компьютерной обработки данных и в


иных особых случаях. Такие альтернативные или автомати­зированные методы или процедуры подлежат валидации. Од­нако, фармакопейные стандарты и процедуры взаимосвяза­ны; поэтому при возникновении разногласий или споров ре­шающим является только результат, полученный с использо­ванием метода, описанного в Фармакопее».

Из приведенного текста ясно, что проведение анализа альтернативными методами допускается, но эти методы должны быть валидированы и доказано соответствие резуль­татов, полученных при фармакопейном и альтернативном анализе. Следует иметь ввиду, что FDA может сделать заклю­чение о несоответствии только на основании анализов, опи­санных в USP. Также очевидно, что при расхождении резуль­татов фармакопейного и альтернативного анализа при арбит­ражной проверке используется фармакопейная методика. По­этому так необходима всесторонняя валидация альтернатив­ных экспресс методов, чтобы свести возможность таких рас­хождений результатов к минимуму.


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 |

Поиск по сайту:



Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.062 сек.)