Методические указания. § I. Вскрыть, соблюдая необходимые правила (см.занятие 3), куриный эмбрион и отсосать пастеровской пипеткой аллантоисную жид­кость

§ I. Вскрыть, соблюдая необходимые правила (см.занятие 3), куриный эмбрион и отсосать пастеровской пипеткой аллантоисную жид­кость. Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяется с помощью реакции гемагглютинации вначале на стекле, а затем в пробирках (для определения титра вируса).

Реакция гемагглютинации обусловлена способностью ортомиксовирусов, имеющих гемагглютинин, взаимодействовать с мукопептидами оболочки эритроцитов ряда животных и птиц. В результате этого взаи­модействия происходит склеивание эритроцитов.Реакцию ставят в бак­териологических пробирках или на предметных стеклах. Для получения эритроцитов у петухов берут кровь из подкрыльцовой вены стерильным шприцем и дефибринируют в баночке с бусами. Эритроциты фильтруют через марлю, осаждают центрифугированием и трижды отмывают физио­логическим раствором. Из осадка эритроцитов готовят 1-2%-ную взвесь на физиологическом растворе. В пробирках готовят последовательные разведения вируса - 1:10, 1:20, 1:40 и т.д. - в объеме I мл и добавляют равные объемы взвеси эритроцитов. Для контроля на отсутствие спонтанной агглютинации в одну из пробирок эритроциты добавляют не к вирусной суспензии, а к физиологическому раствору. Пробирки тщательно встряхивают и помещают в термостат при 37⁰ на 30 мин. Учет реакции производят по форме осадка эритроцитов. Там, где прошла агглютинация, осадок эритроцитов напоминает развернутый зонт. Если агглютинации нет, эритроциты оседают на дно пробирки в вида круглого диска с ровными краями. То последнее разведение ви­руса, которое еще дает агглютинацию эритроцитов не менее, чем на 3+, носит название гемагглютинирующего титра вируса.

Поставить РТГА на стекле для определения типа вируса в аллантоисной жидкости (см.схему).

§ 2. О наличии и размножении вируса полиомиелита в клетках культуры тканей узнают по цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки ткани гибнут и под микроскопом обнаружи­ваются дегенеративные изменения. Клетки образуют симпласты, часто округляются и отторгаются пластами от стенок пробирки. В культуре ткани, не зараженной вирусами, под влиянием продуктов метаболизма клеток рН среды изменяется в кислую сторону и цвет индикатора ме­няется на желтый. Если в исследуемом материале имеется вирус полио­миелита, то клетки гибнут, рН среды меняется незначительно - среда сохраняет розовый цвет.

Рис.1 Определение типа вируса грипп с помощью реакции торможения гемагглютинации.

В каплю аллантоисной жидкости прибавляют каплю типовой сыворотки и каплю 5%-ной взвеси эритроцитов.

Рис.2 ЦПЭ, вызванный вирусом полиомиелита в культуре ткани.

Рис.3 Бляшкообразование в культуре ткани, зараженной вирусом полиомиелита.

§ 3. Для диагностики вирусных гепатитов могут быть использованы методы:

А. Для обнаружения вируса - заражение животных (обезьяны шимпанзе, мармозеты; электронная и иммуноэлектронная микроскопия.

Б. Для обнаружения антител к вирусу (или к его антигенам) иммунологические реакции: РСК, гемагглютинация иммунного прилипания, иммунофлуоресценция, иммуноферментный и радиоиммунный методы, реак­ция пассивной гемагглютинации и др.способы.

Наиболее специфичным методом диагностики гепатита А является использование иммуноферментного метода "захвата" антител класса IgМ. Суть метода. На стенках полистироловых луночек вначале адсорбируют антитела против IgM(анти-IgM, затем добавляют исследуемую сыворот­ку, в которой определяют наличие антител класса IgМ к вирусу гепатита А. Если они имеются, то образуется комплекс IgM- анти IgM. Далее добавляют специфический антиген (вирус гепатита А)-который связывается с противовирусными антителами. Для обнаружения образовавшегося комплекса добавляют противовирусные антитела; меченные ферментом (пероксидазой). После отмывания луночек в них добавляют субстрат для фермента (ортофенилендиамин) и определяют интенсивность образу­ющейся окраски. Схема.

Поиск по сайту: