 |
АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция
Общая характеристика вирусов
Стремительные темпы развития вирусологии во второй половине XX в. позволили получить важнейшие сведения о структуре и химическом составе разных вирусов, в том числе их генома, а также о характере взаимодействия с клетками хозяев. Полученные материалы свидетельствуют о том, что вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной - вирион и внутриклеточной - вирус. Вирион наиболее простого вируса представляет собой нуклеопротеид, в состав которого входит вирусный геном, защищенный белковой оболочкой - капсидом. В то же время внутриклеточный вирус есть самореплицирующаяся форма, не способная к бинарному делению.
Тем самым в определение вируса закладывается принципиальное различие между клеточной формой микроорганизмов, размножающихся бинарным делением, и реплицирующейся формой, воспроизводящейся только из вирусной нуклеиновой кислоты. Однако качественное отличие вирусов от про- и эукариот не ограничивается только одной этой стороной, а включает ряд других:
· наличие одного типа нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК);
· отсутствие клеточного строения и белоксинтезирующих систем;
· возможность интеграции в клеточный геном и синхронной с ним репликации.
Вместе с тем вирусы отличаются от обычных репликонов, какими являются молекулы ДНК всех микроорганизмов и любых других клеток, а также плазмид и транспозонов, поскольку упомянутые репликоны являются биомолекулами, которые нельзя отнести к живой материи.
Классификация и таксономия вирусов. Вирусы составляют царство Vira, которое подразделено по типу нуклеиновой кислоты на два подцарства - рибовирусы и дезоксирибовирусы. Подцарства делятся на семейства, которые в свою очередь подразделяются на роды. Понятие о виде вирусов пока еще четко не сформулировано, так же как и обозначение разных видов.
В качестве таксономических характеристик первостепенное значение придается типу нуклеиновой кислоты и ее молекулярно-биологическим признакам: двунитевая, однонитевая, сегментированная, несегментированная, с повторяющимися и инвертированными последовательностями и др. Однако в практической работе прежде всего используются характеристики вирусов, полученные в результате электронно-микроскопических и иммунологических исследований: морфология, структура и размеры вириона, наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида), антигены, внутриядерная или цитоп-лазматическая локализация и др. Наряду с упомянутыми признаками учитываются резистентность к температуре, рН, детергентам и т.д.
В настоящее время вирусы человека и животных включены в состав 18 семейств. Принадлежность вирусов к определенным семействам определяется типом нуклеиновой кислоты, ее структурой, а также наличием или отсутствием внешней оболочки. При определении принадлежности к семейству ретровирусов обязательно учитывается наличие обратной транскриптазы.
Морфология и структура вирионов
Размеры вирионов различных вирусов варьируют в широких пределах: от 15-18 до 300-400 нм. Они имеют разнообразную форму: палочковидную, нитевидную, сферическую форму параллелепипеда, сперматозоидную (рис. 5.1). Структура простого вириона - нуклеокапсида - свидетельствует о том, что вирусная нуклеиновая кислота - ДНК или РНК - надежно защищена белковой оболочкой - капсидом. Последний имеет строго упорядоченную структуру, в основе которой лежат принципы спиральной или кубической симметрии. Капсиды палочковидных и нитевидных вирионов состоят из структурных субъединиц, уложенных в виде спирали вокруг оси. При таком расположении субъединиц образуется полый канал, внутри которого компактно уложена молекула вирусной нуклеиновой кислоты. Ее длина может во много раз превышать длину палочковидного вириона. Например, длина вируса табачной мозаики (ВТМ) 300 нм, а его РНК достигает величины 4000 нм, или 4 мкм. При этом РНК настолько связана с капсидом, что ее нельзя освободить, не повредив последний. Подобные капсиды встречаются у некоторых бактериальных вирусов и у вирусов человека (например, вируса гриппа).
Сферическая структура вирионов определяется капсидом, построенном по принципам кубической симметрии, в основе которой лежит фигура икосаэдра - двадцатигранника. Капсид состоит из асимметричных субъединиц (полипептидных молекул), которые объединены в морфологические субъединицы - капсомеры. Один капсомер содержит 2, 3 или 5 субъединиц, расположенных по соответствующим осям симметрии икосаэдра. В зависимости от типа перегруппировки и числа субъединиц число капсомеров будет равным 30, 20 или 12. На рис. 5.1 представлены возможные типы простых вирионов, состоящих из определенного количества капсомеров, изображенных в виде шариков, а также капсомеров увеличивающегося объема.
Вирионы со сложным капсидом, построенным более чем из 60 структурных субъединиц, содержат группы из 5 субъединиц - пен-тамеры, или из 6 субъединиц - гексамеры. Нуклеокапсид сложноорганизованных вирионов, называемый «сердцевиной», покрыт внешней оболочкой - суперкапсидом.
Химический состав вирионов
В состав простых вирионов входит один тип нуклеиновой кислоты - РНК или ДНК - и белки. У сложных вирионов в составе внешней оболочки содержатся липиды и полисахариды, первые получают из клеток хозяина, вторые в виде гликопротеидов закодированы в геноме вируса.
Вирусные ДНК. Молекулярная масса ДНК разных вирусов колеблется в широких пределах (1 * 106- 1 * 108). Она примерно в 10-100 раз меньше молекулярной массы ДНК бактерий. В геноме вирусов содержится до нескольких сотен генов. По своей структуре вирусные ДНК характеризуются рядом особенностей, что дает возможность подразделить их на несколько типов. К ним относятся двунитевые и однонитевые ДНК, которые могут иметь линейную или кольцевую форму.
Хотя в каждой нити ДНК нуклеотидные последовательности встречаются однократно, на ее концах имеются прямые или инвертированные (повернутые на 180°) повторы. Они представлены теми же нуклеотидами, которые располагаются в начальном участке ДНК. Нуклеотидные повторы, присущие как однонитевым, так и двунитевым вирусным ДНК, являются своеобразными маркерами, позволяющими отличить вирусную ДНК от клеточной. Функциональное значение этих повторов состоит в способности замыкаться в кольцо. В этой форме она реплицируется, транскрибируется, приобретает устойчивость к эндонуклеазам и может встраиваться в клеточный геном.
Вирусная РНК. У РНК-содержащих вирусов генетическая информация закодирована в РНК таким же кодом, как в ДНК всех других вирусов и клеточных организмов. Вирусные РНК по своему химическому составу не отличаются от РНК клеточного происхождения, но характеризуются разной структурой. Наряду с типичной однони-тевой РНК у ряда вирусов имеется двунитевая РНК. При этом она может быть линейной и кольцевой. В составе однонитевых РНК имеются спиральные участки типа двойной спирали ДНК, образующиеся вследствие спаривания комплементарных азотистых оснований. Однонитевые РНК в зависимости от выполняемых ими функций разделяют на две группы.
Внешняя оболочка сложных вирионов состоит из белков, которые входят в состав гликопротеидов и гликолипидов. У многих вирионов они распространяются в виде шиловидных отростков на поверхности суперкапсида. Гликопротеидные шипы обладают антигенными свойствами. Многие из них ответственны за адсорбцию на специфических рецепторах клетки и принимают участие в слиянии с клеточной мембраной, обеспечивая тем самым проникновение вири-она в клетку хозяина. Наряду с упомянутыми соединениями в составе суперкапсида имеются гликолипиды. Липидный и углеводный состав вириона определяется клеткой хозяина, но модифицируется суперкапсидными белками. Липиды стабилизируют структуру сложных вирионов.
Ферменты вирусов. В отличие от прокариот и клеток всех других организмов, вирусы лишены ферментов, участвующих в многочисленных метаболических реакциях. Однако многие вирусы содержат в составе капсидов одну или две группы ферментов. К первой относятся ферменты репликации и транскрипции, ко второй - ферменты, участвующие в проникновении вирусной нуклеиновой кислоты в клетку хозяина и выходе образовавшихся вирионов (нейраминидаза, лизоцим, АТФ-аза).
Ферменты вирусов подразделяют на вирионные и вирусиндуцированные. К первым относят ферменты транскрипции и репликации (ДНК- и РНК-полимеразы), обнаруженные у многих вирусов, обратная транскриптаза ретровирусов, а также эндо- и экзонуклеазы, АТФ-аза, нейраминидаза отдельных вирусов.
Вирусиндуцированными считаются те ферменты, структура которых закодирована в вирусном геноме. Прежде всего это относится к РНК-полимеразам пикорна-, тога-, орто- и парамиксовирусам, а также ДНК-полимеразе покс- и герпесвирусов. Наряду с собственными вирусы используют клеточные ферменты, которые не являются вирусспецифическими. Однако их активность может модифицироваться в процессе репродукции вируса.
8 Основной таксономической единицей систематики бактерий является вид.
Вид – это эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющая единый генотип, который в стандартных условиях проявляется сходным морфологическими, физиологическими, биохимическими и другими признаками.Вид не является конечной единицей систематики. Внутри вида выделяют варианты микроорганизмов, отличающиеся отдельными признаками. Так, различают:1) серовары (по антигенной структуре);2) хемовары (по чувствительности к химическим веществам);3) фаговары (по чувствительности к фагам);4) ферментовары;5) бактериоциновары; 6)бактериоциногеновары. Бактериоцины – вещества, продуцируемые бактериями и губительно действующие на другие бактерии. По типу продуцируемого бактериоцина различают бактериоциновары, а по чувствительности – бактерициногенов ары. Для видовой идентификации бактерий необходимо знать следующие их свойства: 1) морфологические (форму и структуру бактериальной клетки);2) тинкториальные (способность окрашиваться различными красителями);3) культуральные (характер роста на питательной среде);4) биохимические (способность утилизировать различные субстраты);5) антигенные. Виды, связанные генетическим родством, объединяют в роды, роды – в семейства, семейства – в порядки. Более высокими таксономическими категориями являются классы, отделы, подцарства и царства.Согласно современной систематике патогенные микроорганизмы относятся к царству прокариот, патогенные простейшие и грибы – к царству эукариот, вирусы объединяются в отдельное царство – Vira. Все прокариоты, имеющие единый тип организации клеток, объединены в один отдел – Bacteria. Однако отдельные их группы отличаются структурными и физиологическими особенностями. На этом основании выделяют:1) собственно бактерии; 2) Актиномицеты, или лучистые грибы, — низшие растительные организмы, широко распространенные в природе, особенно в почвах, богатых органическими веществами; 3) Спирохеты (от лат. spira — изгиб, chatie — грива) — спирально извитые одноклеточные организмы. Число витков у спирохет может достигать 10—15; 4) Риккетсии — большая группа микроорганизмов, которые являются строгими (облигатными) внутриклеточными паразитами, размножающимися в клетках тканей позвоночных и членистоногих.; 5) Хламидии - патогенные грамотрицательные облигатные внутриклеточные бактерии. Хламидии имеют размеры 250-300 нм и при первичном инфицировании поражают клетки основных барьерных систем организма.;6) микоплазмы- прокариотные одноклеточные, грамотрицательныемикроорганизмы, не имеющие клеточной стенки, которые были открыты при изучении плевропневмонии у коров. Микоплазмы, по всей видимости, являются наиболее простыми самостоятельно воспроизводящимися живыми организмами, объём их генетической информации в 4 раза меньше, чем у Escherichia coli.
10. Питательные среды
Известно очень много питательных сред для культивирования микроорганизмов (более двух тысяч наименований было классифицировано Левином и Шенлейном еще в 1930 г.), но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико. Однако качественный диапазон этих сред весьма широк — от растворов неорганических солей, на которых могут расти автотрофы, до сложных питательных сред, приготавливаемых из мясных гидролизатов, обогащенных кровью или сывороткой; ими обычно пользуются для выделения патогенных микроорганизмов типа стрептококков, отличающихся высокой требовательностью к составу питательной среды. Различают два основных типа питательных сред: так называемые синтетические среды, главные составные части которых точно известны (например, глюкозо-солевая питательная среда), и эмпирически подобранные питательные среды природного происхождения, состав которых точно неизвестен (к ним относятся пептоны, приготавливаемые из частично гидролизованного белка).
Выбор питательной среды зависит в значительной степени от цели эксперимента. Герберт настойчиво высказывался за повсеместное использование синтетических питательных сред. Однако следует признать, что они обладают рядом практических неудобств. Микроорганизмы, выращенные на таких питательных средах, обычно фенотипически отличаются от выращенных на питательных средах естественного происхождения типа бульона (например, по составу и по скорости деления). Размножение микроорганизмов на таких средах обычно легче подавляется избыточной аэрацией или токсическими катионами; они также более чувствительны к нарушениям баланса между некоторыми составными частями питательной среды, особенно аминокислотами. Многие бактерии нуждаются в большом числе факторов роста, и для некоторых из них до сих пор не найдены искусственные среды, на которых они могли бы размножаться. Возможно, что все эти неудобства со временем будут преодолены, но пока среды неизвестного состава типа бульонов, приготовленных из перевара, используются весьма широко, хотя они и вносят в эксперимент неконтролируемые факторы.
В литературе опубликованы результаты количественных анализов многих питательных сред природного происхождения, что является определенным шагом на пути к их стандартизации. Однако данными этих анализов следует пользоваться с осторожностью, поскольку результаты определений, проведенных независимо друг от друга, демонстрируют существенные различия состава различных партий одной и той же питательной среды. Более того, при проведении анализов обычно игнорируется наличие в питательных средах многих существенно важных составных частей, хотя ясно, что компоненты, требуемые в следовых количествах, например витамины и катионы, могут присутствовать в исключительно малой концентрации. При этом может оказаться, что размножение бактерий идет нормально, тогда как процессы типа споруляции или адсорбции фага ингибируются.
В состав сред, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы элементы: азот, углерод, водород, кислород, неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо, микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении неодинаковы. Потребность в кислороде и водороде бактерии удовлетворяют главным образом за счет поступающей в клетку воды.
По характеру усвоения азота патогенные микроорганизмы делятся следующим образом: одни из них извлекают азот из простых аммонийных соединений, другие нуждаются в аминокислотах, третьи расщепляют высокомолекулярные вещества — пептоны, представляющие собой продукты неполного ферментативного переваривания белков. Строго паразитические виды бактерий размножаются только в присутствии нативного, т. е. неизмененного, белка.
Источником углерода для патогенных бактерий являются, главным образом, различные углеводы: сахар, многоатомные спирты, органические кислоты и их соли.
Потребность бактерий в неорганических элементах удовлетворяется прибавляемыми к питательной среде солями: NaCI, KH2PO4, K2HPO4 и т. д. Микроэлементы, выполняющие роль катализаторов химических процессов, необходимы в ничтожно малых количествах и поступают в питательную среду с пептоном, неорганическими солями и водой.
Наряду с перечисленными органическими и неорганическими элементами бактерии нуждаются в ростовых факторах, которые по своей роли соответствуют витаминам для животных. Источником факторов роста являются прибавляемые к питательной среде продукты растительного и животного происхождения, содержащие в своем составе никотиновую, пантотеновую, парабензойную кислоты, витамины А, В, С и др.
Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, так как проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды.
Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.
По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные питательные среды готовят из жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ - агара или желатина. Агар-агар (по малайски – желе) — продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80—86°С, застудневает при 36—40°С. Применение агаровых сред благодаря их способности сохранять плотность при температуре 37°С дало возможность выращивать патогенные микробы при оптимальной для большинства из них температуре на плотных средах. Желатин — вещество белковой природы животного происхождения. В теплой воде при температуре 32—34°С он набухает и растворяется, а при более низкой температуре превращается в студень. Однако при рН ниже 6,3 и выше 7,0 плотность желатина уменьшается, и он плохо застывает.
Исходные продукты для приготовления питательных сред. Для приготовления питательных сред используют:
· Продукты животного происхождения (мясо, рыба, казеин, молоко, яйца, кровь и т. д.).
· Продукты растительного происхождения (картофель и др.).
· Органические и неорганические соединения определенного химического состава.
Питательные среды, приготовленные из продуктов растительного и животного происхождения, несмотря на то, что они не могут быть стандартны и не имеют определенного химического состава, находят широкое применение в практике микробиологии. Синтетические питательные среды, составленные из химических соединений, используют преимущественно для изучения обмена веществ микробной клетки.
Требования, предъявляемые к питательным средам. Питательные среды должны:
· Содержать необходимые для питания микроба питательные вещества.
· Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.
· Иметь достаточную влажность, так как микробы питаются по законам диффузии и осмоса.
· Обладать изотоничностью.
· Быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микробов.
Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные.
К первой группе относятся мясо-пептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроба.
К специальным питательным средам относятся элективные (избирательные) и дифференциально-днагностическне.
Элективные (избирательные) среды. Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены. Определенный состав и концентрация питательных микроэлементов, ростовых факторов при строгом значении рН обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной.
Дифференциально-диагностические питательные среды.
Дифференциально-диагностические питательные среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды подразделяются следующим образом:
· Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровяную сыворотку и т. д.
· Среды с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами.
· Среды с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов.
· Среды для определения редуцирующей способности микробов.
В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральный красный, метиленовый синий, лакмусовую настойку, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой краситель и розоловую кислоту. Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие или отсутствие расщепления, окисления или восстановления введенного в среду ингредиента. Однако индикатор не является обязательной составной частью сред, предназначенных для выявления ферментов. Так, наличие желатиназы и других протеолитических ферментов в культуре определяют по разжижению желатина, свернутого яичного или сывороточного белка.
Сухие питательные среды.
Приготовление питательных сред — один из наиболее ответственных и трудных участков работы бактериологической лаборатории. В связи с этим биопромышленность выпускает стандартные, консервированные, сухие питательные среды, различного назначения, для культивирования микроорганизмов.
Приготовление обычных питательных сред. Основой для приготовления этих сред служит мясная вода, содержащая экстрактивные вещества.
Классификация сред
Среды классифицируют по консистенции, составу, происхождению, назначению и загрязнённости материала.
По консистенции питательные среды разделяют на плотные (твёрдые)их готовят путём добавления к жидкой среде 1,5-2% агара, полужидкие- 0,3-0,7%агараи жидкие.
По составу выделяют белковые, безбелковые и минеральные среды.
По происхождению среды разделяют на искусственные и естественные (природные).
Искусственные среды разделяют на животные [например, мясопептонный агар (МПА) или мясопептонный бульон (МПБ)] и растительные (например, настои сена и соломы, отвары злаков, дрожжей или фруктов, пивное сусло и др.).
Естественные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.
По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культивирования (универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентификации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).
По загрязнённости материала. Если материал слабо загрязнён посторонней микрофлорой, то для выделения чистых культур применяют простые (по составу) среды. При обильной контаминации сапрофитами используют специальные или элективные (для отдельных видов), селективные (только для отдельных бактерий), дифференциально-диагностические (для облегчения идентификации) среды.
Аэробное культивирование — аэрация среды — непременное условие в тех микробиологических процессах, в которых используются аэробные микроорганизмы-продуценты.
Потребность аэробных микроорганизмов в молекулярном кислороде зависит от окисляемого источника углерода и от физиологических свойств и активности роста микроорганизмов. Для биосинтеза 1 кг дрожжевой биомассы необходимо, например, 0,74–2,6 кг молекулярного кислорода. При интенсивном потреблении субстрата независимо от источника углерода продуцент ассимилирует 0,83–4,0 мг кислорода/1 л среды/мин.
Растворимость кислорода в среде сравнительно низка и зависит от температуры, давления и от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов (табл. 1). При давлении 0,1 МПа и температуре 30°С в 1 л дистиллированной воды максимальное количество растворенного кислорода составляет 7,5 мг. В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода колеблется в интервале 2–5 мг/л. Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента в течение 0,5–2 мин.
При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Скорость абсорбции кислорода увеличивается с ростом интенсивности перемешивания среды (табл. 2).
Во время роста биомассы микроорганизмы обычно потребляют больше кислорода, чем во время сверхсинтеза целевого метаболита. Принято говорить о критической концентрации кислорода, при которой наблюдается лимитация дыхания клеток. Для большинства аэробных микроорганизмов, растущих в сахаросодержащих субстратах, критическая концентрация кислорода 0,05–0,10 мг/л, что соответствует 3–8 % от полного насыщения среды кислородом. Лимитация роста и физиологической деятельности клеток наблюдается при более высоких концентрациях кислорода: на средах с глюкозой рост дрожжей лимитируется при рО2 на уровне 20–25 % от полного насыщения.
Оптимальной для роста биомассы считается концентрация кислорода 50–60 % от полного насыщения, для биосинтеза целевых метаболитов — 10–20 %.
Температура культивирования
Патогенные бактерии вариабельны в отношении температур, оптимальных для их роста, но большинство из них неплохо развивается при 35-37 °С. Исключение составляют некоторые атипичные микобактерии, возбудитель чумы, листерии и лептоспиры (температурный оптимум 20-30 °С), а также Campylobacter jejuni (температурный оптимум 42 °С).
5.3. Состав газовой среды
Бактерии чётко разделяют по отношению к содержанию кислорода в атмосфере культивирования.
Аэробы. Посевы аэробных бактерий культивируют в простых термостатах. Некоторые факультативно анаэробные виды также можно культивировать при атмосферном воздухе, но более оптимально помещение посевов в термостаты с дозированной подачей кислорода. На практике их чаще помещают в эксикаторы, куда вносят горящую свечу; после её выгорания в атмосфере снижается содержание кислорода и повышается содержание СО2. Методы культивирования
При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред. В соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на периодические (при стационарном и глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном культивировании).
Стационарный способ — наиболее часто используемый на практике. Состав сред остаётся постоянным, с ними не проводят никаких дополнительных манипуляций.
Микроорганизмы выращивают на поверхности плотной или в тонком слое жидкой среды, и кислород поступает к ним непосредственно из воздуха. При поверхностном культивировании важно увеличить площадь соприкосновения среды с воздухом. Для этого среды наливают тонким слоем в чашки Петри, колбы Виноградского, матрацы. В жидких средах аэробы часто растут, образуя на поверхности плёнку. Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее её помутнение.
Способ глубинного культивирования применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены системами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, перемешивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, чтоспособствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следовательно, максимальному выходу биомассы.
Простой и широко распространённый способ глубинного культивирования - выращивание на качалках, обеспечивающих встряхивание или вращение пробирок со скоростью 100-200 и более оборотов в минуту. Чем больше скорость вращения, тем больше соприкосновение с воздухом и выше насыщение её кислородом. Увеличить аэрацию среды при работе на одной и той же качалке можно уменьшением объема среды или применением колб с отбойниками. При вращении колб с отбойниками поверхность соприкосновения среды с воздухом увеличивается благодаря разбрызгиванию жидкости. Чем больше отбойник, тем сильнее разбрызгивание жидкости, тем выше аэрация.
Аэрировать культуру можно продуванием через толщу среды стерильного воздуха. Этот способ нашёл широкое применение в промышленной микробиологии при получении биомассы и различных продуктов жизнедеятельности микроорганизмов-антибиотиков, ферментов, кислот. Воздух стерилизуют путём прохождения через активированный уголь, стеклянную вату, пропитанную антисептиком или специальные ткани из полимеров. Для аэрации культур используют обычный воздух.
Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно поддерживать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пребывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различных БАВ (витамины, антибиотики и др.).
Культивирование анаэробов возможно как на обычных средах (МПБ, МПА и МПЖ) с добавлением глюкозы (2%), так и на специальных (кровяном агаре, печеночном бульоне и пр.). Большое значение имеет добавление к средам веществ, обладающих восстановительными свойствами, именно: мура вьинокислого натрия (0,3—0,5); индигокармина (0,1%); глюкозы (1—2%), кусочков свежевырезанных паренхиматозных органов (печень, почка, мозг).
Необходимо всегда перед посевом анаэробов в среды удалять из них кислород. Последнее достигается кипячением жидких сред в водяной бане не менее 10 мин. После кипячения среды быстро охлаждаются погружением в холодную проточную воду или лед.
После посева анаэробов необходимо создать бескислородные условия для их развития. Последнее достигается различными приемами.
1. Механическое прекращение доступа кислорода воздуха достигается для жидких сред наливанием слоя вазелина или парафинового масла на поверхность среды и посевами в глубокие ее слои, а для плотных сред — посевами в расплавленный высокий агар с быстрым охлаждением его, закрыванием засеянной плотной среды слюдяной пластинкой или заливанием вторым слоем расплавленной плотной среды.
2. Замещение воздуха индиферентным газом в пробирках или сосудах, где находятся пробирки. Для этой цели могут служить углекислота и водород.
3. Выкачивание воздуха из пробирок или сосудов (эксикатор, стеклянный колокол) при помощи насосов.
4. Химическое поглощение кислорода. На 100 мл воздуха берут 1 г пирогалловой кислоты и 10 мл 1-проц. едкого натра или на 100 мл воздуха берут 3,0 г гидросульфита натрия и такое же количество углекислого натрия. Смесь слегка овлажняют водой и перемешивают.
11. Культура Накопительная культура накопительная начальный этап получения чистой культуры микроорганизма из природных субстратов. Заключается в создании элективных (избирательных) условий для роста организма определенного вида или группы сходных видов, при которых он (они) преодолевает(ют) конкуренцию других микроорганизмов. В качестве элективных факторов могут выступать–кислая реакция питательной среды (для получения культуры ацидофилов), отсутствие источника азота в среде (выделение азотфиксаторов), предварительное прогревание культуры (выделение спорообразующих бактерий) и др.
Элект и вные культ у ры, клетки микроорганизмов, выращенные на избирательных (элективных) питательных средах. Предложены русским микробиологом С. Н. Виноградским. Благодаря специально подобранному составу элективных сред создаются условия, благоприятные для преимущественного роста микроорганизмов с определёнными физиологическими свойствами. Например, при посеве почвы, воды или грунта водоёмов в питательную среду, в состав которой входят глюкоза и ряд минеральных солей, но отсутствуют соединения, содержащие азот, на ней начинают расти азотфиксирующие микроорганизмы. Э. к. бактерий, разлагающих целлюлозу, получают на питательной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода целлюлозу. Выделению чистых культур этих микробов всегда предшествует получение их Э. к. В присутствии факторов роста (витаминов, аминокислот и др.) Э. к. могут быть получены при внесении в питательную среду меньшего количества клеток бактерий, что позволяет обнаруживать в почве и воде в 4—10 раз больше микробов, чем при посевах на среды без факторов роста.
Накопительной называют такую культуру, в которой преобладают представители одной физиологической группы или даже одного вида микроорганизмов. Метод накопительных культур был введен в практику микробиологических исследований С. Н. Вино-градским и М. Бейеринком. Сущность его заключается в создании элективных, т. е. избирательных условий, которые обеспечивают преимущественное развитие желаемых микроорганизмов или группы микроорганизмов из смешанной популяции.
При создании элективных условий необходимо знать физиологию или четко представлять те особенности, которыми должны обладать выделяемые микроорганизмы. Элективные условия создают чаще всего, подбирая соответствующие среды, поскольку различные микроорганизмы для своего развития предъявляют неодинаковые требования к источникам питания. Например, микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот, могут расти в среде, из состава которой исключены связанные формы азота. Если внести в такую среду почву, то из громадного разнообразия имеющихся в ней микроорганизмов в первую очередь будут развиваться азотфиксаторы. Накопительные культуры ав-тотрофных микроорганизмов получают на средах, где единственным источником углерода служит углекислота. Отсутствие в среде других соединений углерода задерживает развитие гетеротрофов. Такие специфические питательные среды, удовлетворяющие потребности преимущественно одной группы микроорганизмов, носят название элективных. В зарубежной литературе большее распространение получили термины «накопительные» или «селективные» среды.
Накопительные культуры микроорганизмов, обладающих высокой требовательностью к составу питательных сред, получают иначе. При их выделении используется неодинаковая чувствительность клеток смешанной популяции к продуктам обмена веществ, накапливающимся в среде. Примером могут служить молочнокислые бактерии, для накопления которых используют солодовое сусло без мела, т. е. среду, первоначально не обладающую элективностью. После внесения природного материала, содержащего молочнокислые бактерии, в среде вначале наряду с молочнокислыми бактериями хорошо развиваются представители родов Enterobacter и Escherichia. Однако по мере накопления в среде молочной кислоты и этилового спирта, образуемого гетерофер-ментативными видами, условия для развития энтеробактерий и эшерихий постепенно ухудшаются, тогда как молочнокислые бактерии, которым свойственна высокая кислото- и спиртоустойчи-вость, продолжают расти. Таким образом, в результате развития молочнокислых бактерий среда приобретает необходимую степень элективности, что и обеспечивает получение накопительной культуры этих бактерий. Другим примером могут служить уксуснокислые бактерии, которые характеризуются высокой устойчивостью к этиловому спирту. Накопление этих бактерий осуществляют на сусле, к которому добавляют 4—5% этанола.
Иногда при выделении микроорганизмов из природных популяций в среду включают антибиотики, которые отличаются специфичностью действия и позволяют избирательно подавить рост определенной группы микроорганизмов. Так, элективные условия для развития грамотрицательных бактерий можно создавать внесением в среду пенициллина в концентрации от 0,2 до 100 мг/л, поскольку многие виды грамположительных бактерий при этом или совсем не развиваются, или развиваются медленно. Чтобы создать благоприятные условия для развития бактерий и, напротив, подавить рост мицелиальных грибов, к средам рекомендуют добавлять нистатин в концентрации от 0,1 до 20 мг/л или гризео-фульвин в концентрации от 1 до 20 мг/л.
При создании элективных условий следует учитывать неодинаковое отношение различных микроорганизмов к аэрации, температуре, кислотности среды и т. д. Поэтому при получении накопительной культуры аэробных микроорганизмов обеспечивают большую поверхность контакта среды с воздухом, а для обогащения среды анаэробными микроорганизмами тем или иным способом создают анаэробные условия. Культивирование при высокой температуре (50° и выше) исключает развитие мезофильных микроорганизмов и обеспечивает рост термофилов.
13. Микроскопирование
1.Световая микроскопия (самыми маленькими объектами, которые еще можно наблюдать в световой микроскоп, являются бактерии и митохондрии (их ширина ~ 0,5 мкм). Более мелкие элементы клетки искажаются эффектами, вызванными волновой природой света).
2.Специальные методы: фазово-контрастный (метод микроскопического исследования, основанный на получении с помощью специальных приспособлений контрастного изображения различающихся по плотности структур бесцветных прозрачных микрообъектов, например живых микроорганизмов и тканевых культур; Фазовоконтрастный микроскоп применяется для изучения неокрашенных препаратов, живых объектов, размножения микроорганизмов и т. д. Исследование таких объектов может проводиться и в затемненном поле зрения (при суженной диафрагме и опущенном конденсоре) и в темном поле), темнопольный (Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые бактерии. Для темнопольной микроскопии используют темнопольный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала), люминесцентный (метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав), интерференционный (как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток и применяются во многих случаях именно с этой целью), поляризационный (метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр.). ОКРАСКА МИКРООРГАНИЗМОВ - комплекс методов и приемов, применяемый для изучения морфологических свойств микроорганизмов. В нативном (естественном) состоянии бактерии имеют такой же коэффициент преломления, как и стекло, поэтому они невидимы под микроскопом. Благодаря О. м. можно изучать их морфол. особенности, что необходимо при проведении бактериологического исследования. Окрашивание бактерий производится как для обнаружения их в исследуемом материале при бактериоскопической диагностике, так и для их идентификации после выделения чистой культуры из исследуемого материала при бактериол. исследовании.
Приготовление окрашенного препарата состоит из следующих этапов: приготовление мазка, его высушивание, фиксация и окраска. Для приготовления мазка на середину чистого предметного стекла наносят небольшую каплю воды и с помощью бактериальной петли помещают в нее исследуемый материал. Материал равномерно распределяют на стекле таким образом, чтобы образовался тонкий мазок круглой или овальной формы размером 1-2 см2. Затем препарат высушивают либо при комнатной температуре на воздухе, либо в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Высушенный мазок подвергают фиксации, вследствие чего он прикрепляется к стеклу (фиксируется), микробы инактивируются и становятся безопасными, возрастает их восприимчивость к окраске. Применяют различные способы фиксации. Наиболее простым и самым распространенным способом является фиксация жаром - нагреванием на пламени горелки (препарат несколько раз проводят через наиболее горячую часть пламени горелки). В нек-рых случаях прибегают к фиксации препарата этиловым или метиловым спиртом, ацетоном, смесью равных объемов этилового спирта и эфира (по Никифорову). После фиксации производят окраску мазка. Наиболее пригодными для окраски микробов являются основные и нейтральные анилиновые красители. Окрашенный препарат промывают водой и высушивают. На высушенный мазок наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют, пользуясь иммерсионной системой микроскопа.
Существуют простые и сложные способы окрашивания микробов. При простой окраске, к-рая позволяет быстро изучить морфол. особенности микробов, обычно используют только один краситель, чаще всего красного цвета - фуксин (окраска производится в течение 1-2 мин) или синего цвета - метиленовый синий (время обработки мазка краской 3-5 мин). При сложных методах окраски применяют два или более контрастных красителя, протравы, дифференцирующие вещества и др. Среди сложных методов окраски различают дифференциальные методы и методы, предназначенные для выявления отдельных структур клетки. К дифференциальным методам относятся методы Грама и Циля-Нельсена, позволяющие различать по цвету микроорганизмы, сходные по морфол. свойствам.
Метод окраски по Граму - наиболее распространенный сложный способ окраски. Бактерии в зависимости от того, подвергаются они окраске по этому методу или нет, разделяют на две группы: грамположительные (красящиеся по Граму) и грамотрицательные (не красящиеся) Различие в окраске обусловлено разным строением клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Методика окраски по Граму заключается в последовательной обработке фиксированного мазка: окраске генцианвиолетом через фильтровальную бумагу (1-2 мин), обработке р-ром Люголя (1 мин), обесцвечивании спиртом (1/2-1 мин - до отхождения фиолетовых струек краски), промывании водой, окрашивании фуксином (1-2 мин). Сущность метода состоит в том, что грамположительные бактерии удерживают комплекс краситель - йод и не обесцвечиваются спиртом, грамотрицательные не обладают этим свойством, т. е. обесцвечиваются спиртом (дифференцирующим веществом) и докрашиваются фуксином. В результате грамположительные бактерии приобретают фиолетовый цвет, грамотрицательные - красный.
Метод Циля-Нельсена предназначен для дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых. При окраске по этому методу используют карболовый фуксин Циля, серную к-ту (дифференцирующее вещество) и метиленовый синий. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет карболовым фуксином Циля и не обесцвечиваются к-той, некислотоустойчивые теряют красную окраску при обработке к-той и докрашиваются метиленовым синим.
При изучении структуры микробной клетки используют целый ряд сложных методов. Так, для выявления капсулы у бактерий применяют метод Гинса, для обнаружения спор бактерий - метод Ауески, зерна волютина можно окрасить с помощью метода Нейссера. Для выявления жгутиков используют методы "сверхокраски", при к-рых клетки и отдельные их структуры увеличиваются в размерах и становятся видимыми под световым микроскопом. К методам "сверхокраски" относится, в частности, метод серебрения по Морозову. Он также может быть использован для окрашивания спирохет и даже наиболее крупных вирусов - вирусов оспы.
Универсальным методом О. м. является окраска по Романовскому-Гимзе (смесью азура, эозина и метиленового синего). При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра - красно-фиолетовый. Этот метод используют также при исследовании риккетсий, хламидий, спирохет, форменных элементов крови.
Поиск по сайту: