ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ. Приборы и материалы: светонепроницаемая камера с фотоумножителем (ФЭУ), блок питания ФЭУ, усилитель

Приборы и материалы: светонепроницаемая камера с фотоумножителем (ФЭУ), блок питания ФЭУ, усилитель, пересчетный прибор, осветитель, набор светофильтров, раствор диурона (ДХММ - дихлорфенилдиметилмочевина), листья растений, вакуумная установка.

Установка для регистрации длительного послесвечения листьев растений.

Блок-схема установки для регистрации длительного послесвечения представлена на рисунке 3.

Рис.3. Блок-схема для регистрации послесвечения листьев растений.

1- камера, 2 - осветитель, 3- ФЭУ, 4 - блок питания ФЭУ, 5 - усилитель, 6-пересчетное устройство.

Для регистрации длительного послесвечения используют простые камеры с вращением объекта вручную. Объект помещают в камеру (1), освещают лампой осветителя (2) и быстро поворачивают к ФЭУ (3), на который подается высокое напряжение от блока питания (4).Свечение от объекта регистрируется ФЭУ и в виде сигнала поступает на усилитель (5) и затем на пересчетное устройство (6).

Для регистрации и исследования отдельных компонент послесвечения применяют более сложные специальные устройства - фосфороскопы. Они бывают различных конструкций. Одна из конструкций состоит из трех цилиндров: наружного, среднего и внутреннего. При вращении среднего цилиндра с помощью электромотора через специальное окно попеременно с большой частотой то открывается источник света и объект возбуждается (освещается), то открывается объект перед фотоумножителем, который регистрирует его свечение.

-8-

В данной работе используется простой вариант камеры с вращением объекта вручную для регистрации в целом процесса послесвечения.

Порядок работы на установке

При работе на высоковольтных установках следует соблюдать следующую технику безопасности:

а) все приборы установки должны быть заземлены;

б) включать приборы только в присутствии преподавателя или лаборанта;

в) категорически запрещается включать высоковольтный блок питания при отсоединенном разъеме кабеля;

г) не оставлять включенные приборы на длительное время без присмотра.
Все приборы установки включают за 10 - 15 минут до начала работы.

1. Блок питания ФЭУ (ВСВ-2) включают тумблером "сеть". Подают на ФЭУ высокое напряжение, переключив ручку "выс.напр." в положение "вкл.". Ручку "грубо" ставят на вторую позицию и ручкой "плавно" устанавливают стрелку киловольтметра на деление 1,1 кВ (на ФЭУ будет подано 1100 В).

2. Усилитель УЗ-29 включают тумблером "сеть". На передней панели прибора ручка "род работ" должна стоять в положении "видеоимпульс", а ручка "вх.уровень mV" - в положении "20-40" или "40 - 80" в зависимости от величины сигнала.

3. Пересчетный прибор (ПСО2 - 4) включают клавишей "сеть". Затем нажимают поочередно клавишу "сброс" (сбрасываются импульсы на световом табло и появляются нули), клавишу "N" (устанавливается режим регистрации импульсов), клавишу "I" (устанавливается время в течение которого будут регистрироваться импульсы - 1с), клавишу " " (выбирается знак сигнала). После этого нажимают клавишу "пуск" (запускается счет). На табло начинается счет импульсов за 1с и появляются цифры, которые будут автоматически меняться через определенное время. Поворачивая (вперед, назад) ручку "время индикации" подобрать, чтобы цифры на табло сменялись через 4 - 5 с, т.е. оставались на табло неизменными в течение 4 - 5 с.

-9-

Цифры, которые высвечиваются на табло, показывают фон установки. Для определения среднего значения фона установки записывают 5-6 значений и из них рассчитывают среднее значение. Этот фон затем вычитается из всех результатов экспериментов.

Для того чтобы получить однозначные и достоверные результаты экспериментов, надо освещение и поворот объекта к ФЭУ во всех опытах делать следующим образом. Включить свет и смотреть на световое табло пересчетного устройства. Как только заканчивается очередной счет импульсов фона за 1 с и на табло появляется результат, следует быстро повернуть лист под ФЭУ (сделать 4 поворота ручкой). Поворот надо успеть сделать до начала очередного счета. Очередной счет установка должна начать уже с листа. Через каждые 4 - 5 с на табло будут высвечиваться результаты кинетики затухания послесвечения листа. Следует записать 10 результатов не пропуская ни одного. Затем опыт повторить еще 2 раза. Получаете 3 повторности одного опыта. Находите средние значения для 1, 2, 3,.... 10 результатов опыта. Затем строите кривую, откладывая по оси X - 1, 2, 3,.... 10 результаты, а по оси У - импульсы за 1 с.

После выполнения заданий все приборы выключить тумблерами и клавишей "сеть".

ЗАДАНИЕ 1. Исследование влияния интенсивности света на интенсивность и кинетику послесвечения.

1.Определить фон установки.

2. Вырезать из листа герани пластинку диаметром 1,5 - 2 см и поместить в ячейку камеры. Включить лампу осветителя и установить диафрагмой световое поле на пластинке листа диаметром 1,5 - 2 см.

3. Снять кривую затухания послесвечения листа при освещении его минимальным и максимальным светом (максимальная и минимальная освещенность устанавливается регулятором, который находится на трансформаторе осветителя).

4. Построить график.

-10-

ЗАДАНИЕ 2. Исследование влияния различных участков водимой части спектра (400 - 750 нм) на интенсивность и кинетику послесвечения.

1.Определить фон установки.

2. Установить среднюю интенсивность света.

3. Снять кинетику послесвечения при освещении листа лампой накаливания без светофильтра.

4. Снять кинетику послесвечения при освещении листа лампой накаливания:

а) с красным светофильтром (600 - 750 нм);

б) с синим светофильтром (340 - 420 нм).

5. Построить график.

ЗАДАНИЕ 3. Исследование влияния температуры и диурона на интенсивность и кинетику послесвечения.

1.Определить фон установки.

2. Снять кривую затухания послесвечения листа при средней освещенности. Затем прогреть лист до побурения (инактивировать хлорофилл-белковый комплекс) и вновь снять кривую затухания послесвечения.

3. Приготовить новую листовую пластинку и снять кривую затухания послесвечения. Обработать лист (провести инфильтрацию) 10^-2 М раствором диурона и снять кривую затухания послесвечения.

4. Построить график. При построении графиков выдержать единый масштаб для сравнения результатов. Можно построить все кривые на одном графике.

На основании полученных данных сделать выводы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений, М., 1990г.

2. Моторин Д.Н., Венедиктов П.С., Рубин А.Б. Изв.АН СССР, сер.биолог., № 4, 1985, с.508 - 520.

3. Шувалов В.А., Литвин Ф.Ф. Молекулярная биология, т.З, в.1, 1969, с.59 - 73.

4. Практикум по биофизике, МГУ, 1984.

-11-

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 2

ДИСПЕРСИЯ ЭЛЕКТРОПРОВОДНОСТИ И КОЭФФИЦИЕНТ ПОЛЯРИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Введение

Как известно, электропроводность - величина, обратная сопротивлению проводника: R=pl/s, где р - удельное сопротивление, l - длина проводника, s -сечение проводника. Для выражения электропроводности формула будет иметь вид: a=1/ps/l, где 1/р - удельная электропроводность.

Под электропроводностью биологических объектов понимают их способность проводить переменный или постоянный ток.

Исследования электропроводности на постоянном токе показали, что биосистемы обладают рядом особенностей.

Первая особенность - высокое сопротивление (низкая электропроводность), хотя они содержат значительное количество электролитов. Удельное сопротивление биосистем составляет порядка 10⁶ - 10⁷ Ом/см, что позволяет отнести их к типу полупроводников и даже диэлектриков.Такое высокое сопротивление объясняют, в основном, наличием мембраны и частично протоплазмой. В настоящее время это хорошо доказывается при измерении сопротивления непосредственно мембраны с помощью микроэлектродов.

Вторая особенность - явление поляризации. Поляризация - процесс смещения зарядов под действием электрического поля и образование электродвижущей силы (ЭДС), направленной против внешнего поля. Поэтому при пропускании постоянного тока через клетки и ткани установлено,' что ток после наложения разности потенциалов начинает падать и устанавливается на уровне ниже, чем исходный. Уменьшение тока является следствием снижения напряжения за счет возникновения встречной ЭДС, т.е. за счет поляризации. Различают два типа поляризации на постоянном токе. Первый тип поляризации - ионная, которая связана с наличием свободных ионов в тканях. Она бывает двух видов: поверхностная или мембранная (на поверхности мембраны) и внутренняя или внутри объема клетки (связана с неоднородностью протоплазмы). Второй тип поляризации объясняется наличием в клетке связанных зарядов, где основную роль играют диполи.

-12-

С возникновением поляризации и встречной ЭДС связано видимое отклонение от закона Ома. Однако, если вычислить величину встречной ЭДС из величины приложенного напряжения, то закон Ома окажется приложим для живых систем. Формула закона Ома для биосистем принимает вид: I=V-E/R где Е - ЭДС поляризации. Величина поляризационной емкости тканей вычисляется по формуле:

Ср= ∫ idT / R(Iо – Iγ),

где Ср - поляризационная емкость, R - сопротивление, I - ток, Iо - начальный ток, Iγ - конечный ток. Важно отметить, что высокая поляризационная емкость характерное свойство живых неповрежденных клеток. Помимо поляризационной емкости, в клетках существует и статическая емкость, которая может быть рассчитана по формуле емкости конденсатора:

C=ES/4πd

где Е - диэлектрическая постоянная, S - площадь поверхности пластин конденсатора, d - расстояние между пластинами.

Наличие поляризации на постоянном токе сильно затрудняет определение сопротивления (электропроводности) биосистем. Поэтому для снижения поляризационных явлений при определении сопротивления биологических объектов предложено проводить измерения на переменном токе.

Однако, исследования электропроводности на переменном токе показали, что биосистемы имеют свои особенности.

Первая особенность - сопротивление биосистем переменному току ниже, чем постоянному току и абсолютная величина сопротивления на переменном токе зависит от частоты. Чем больше частота, тем меньше сопротивление. Это уменьшение сопротивления в зависимости от частоты называют дисперсией сопротивления (электропроводности). Дисперсия сопротивления живых тканей является результатом того, что при низких частотах существует поляризация, которая увеличивает сопротивление. С увеличением частоты поляризационные явления значительно снижаются и на величину сопротивления оказываются меньше.

-13-

Отношение сопротивления, измеренного на низкой частоте, где ясно выражена поляризация, к сопротивлению, измеренному на высокой частоте, где поляризационные явления почти пропадают, служит мерой поляризации живой ткани. Введено понятие коэффициента поляризации (К), который является отношением величины сопротивления, измеренного на частоте 10 КГц к сопротивлению, измеренному на частоте 1 МГц: K=R10⁴/R10⁶. Коэффициент поляризации служит хорошим показателем физиологического состояния биологических объектов и используется в практике. Для животных тканей, которые обладают омической (Rw) и емкостной (Xw) составляющими, общее сопротивление называют импедансом (Z). Зависимость импеданса от частоты носит довольно сложный характер (рис.1), однако, используя эквивалентные схемы (различные комбинации омического сопротивления и емкости) в первом приближении можно моделировать электрические характеристики биосистем.

Одной из самых простых моделей является схема (рис.2) с параллельным включением сопротивления (R) и емкости (С), при этом суммарное сопротивление (импеданс) вычисляется по формуле:

,

где w – частота.

Рис.1. Дисперсия импеданса Рис.2. Эквивалентная схема для

живой (1) и мертвой (2) исследования электрических

ткани характеристик биосистем

-14-

Вторая особенность электропроводности на переменном токе - наличие угла сдвига фаз (γ). Угол сдвига фаз у биологических тканей определяется соотношением между емкостной составляющей (Хw) и омической (Rw), т.е. tg γ =Xw/Rw. Угол сдвига фаз для различных тканей является относительно постоянным и может служить характеристикой структуры биосистемы.

Третьей особенностью электропроводности на переменном токе является наличие диэлектрических потерь. Проходя через ткань, часть энергии электрического поля расходуется (чаще в виде тепла) на ориентацию зарядов. Диэлектрические потери характеризуются tg угла диэлектрических потерь (tg δ) и представляет собой отношение омической составляющей (Rw) к емкостной (Хw), т.е. tg δ =Rw/Xw. Диэлектрические потери с увеличением частоты уменьшаются, но не прямолинейно, а по кривой с некоторыми максимумами, что связано с включением и выключением различных видов поляризации. Это дает возможность получать большую информацию о структуре биологических тканей.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Приборы и материалы: мост переменного тока, генератор, осциллограф, магазин емкостей, камера с электродами, плитка, ножницы, скальпель, эфир, растения, лягушка.

Установка для измерения сопротивления биологических объектов.

Сопротивление живого объекта электрическому току или его электропроводность можно изучать различными методами. На рис.3 показана принципиальная мостовая схема для определения сопротивления. Она состоит из моста (1), генератора (2), нуль-прибора (3), магазинов сопротивлений (4) и емкостей (5), электродов (6).

Принцип измерения заключается в том, чтобы с помощью магазина сопротивлений (4) подобрать сопротивление, равное сопротивлению исследуемого объекта (Rx). О равенстве R и Rx судят по нуль-прибору (3). Для точного определения сопротивления объекта включают параллельно магазину сопротивлений (4) магазин емкостей (для компенсации емкости объекта).

-15-

Рис.3. Принципиальная мостовая схема для определения сопротивления биосистем.

Порядок работы на установке.

Собирают установку по схеме, представленной на рис.4.

Рис.4.Блок-схема установки для измерения сопротивления.

1 - генератор, 2 - осциллограф, 3 - мост, 4 - магазин емкостей, 5 - камера с электродами.

-16-

Подключают генератор, осциллограф и мост в сеть на 220 В. Приборы включают за 10 - 12 мин до начала работы.

1.Осциллограф включают тумблером "сеть".

2. Генератор включают тумблером "сеть" и после того как загорится индикаторная лампочка генератора, ставят тумблер "генератор" в положение "вкл.". Затем устанавливают на выходе генератора рабочее напряжение 500 мВ. Для этого переключатель генератора "шкала вольтметра" ставят в положение 10 В, ручку "аттюнеатор" на множитель "х 0,1" (шкала будет составлять 10В х 0,1 = 1В). Ручкой плавно ставят стрелку вольтметра на середину шкалы, что будет соответствовать 500 мВ. Напряжение снимают с выхода генератора "0 - 2 В".

Настройку генератора на нужную частоту производят путем включения диапазона, на котором находится данная частота, и установки шкалы соответствующего диапазона на рабочую частоту. Пример: требуется частота 1 МГц. Включают диапазон "Г" от 0, 5—1, 4 МГц и устанавливают шкалу диапазона "Г" на 1000 КГц = 1 МГц.

3. Мост включают ручкой "Выкл.", устанавливая ее в положение "внеш." со знаком " " т.е. мост включают для работы на переменном токе с внешним индикатором - осциллографом. В окне с индикаторной лампочкой устанавливают режим работы "Ω", т.е. измерение сопротивления в омах. Ручку для грубого подбора сопротивления моста ставят в положение "10²", а два лимба для точного подбора сопротивления в положение "0".

На мосте емкости устанавливают 0,1 микрофарады. При подаче определенной частоты и напряжения 500 мВ на мост на осциллографе должен быть сигнал в виде вертикальной развертки. Амплитуду (высоту) сигнала можно регулировать ручкой осциллографа "усиление по У". Установить амплитуду сигнала 4 - 5см.

Измерение сопротивления биологического объекта производят следующим образом. Объект помещают в камеру между электродами. Камеру присоединяют к клеммам моста "объект измерения". Сначала грубо по шкале моста 10^-2 до 10⁶ подбирают сопротивление таким образом, чтобы сигнал на осциллографе был минимальным по вертикали, но не точка.

-17-

Затем вращают большой лимб и добиваются еще уменьшения сигнала, потом поворачивают малый лимб и находят точку компенсации, при которой на экране осциллографа сигнал должен быть наименьшим и при повороте малого лимба вправо или влево сигнал будет увеличиваться. Это будет говорить о том, что подобранное сопротивление равно сопротивлению объекта. Прежде чем записать найденное значение сопротивления надо убедиться, что сопротивление подобрано правильно. Для этого делают проверку. Переключают большой лимб вправо и влево, при этом сигнал на экране осциллографа должен увеличиваться (отклонение от точки компенсации). То же самое должно получиться при переключении вправо и влево ручки грубого сопротивления.

Если сигнал на осциллографе не меняется, то сопротивление подобрано не правильно. Тогда изменяют первоначально установленное грубое сопротивление на другую величину, например, с 10³ на 10² или 10⁴ и вновь с помощью более точных сопротивлений (лимбов) находят точку компенсации. Снова делают проверку. Если при любом изменении грубого или более точного сопротивления сигнал меняется, то сопротивление подобрано правильно и его записывают. Считывание найденного сопротивления производят вначале с лимбов и умножают его на величину грубого сопротивления. Пример: на внешнем и внутреннем лимбах стоят цифры 1 и 23 соответственно, а ручка грубого сопротивления установлена в положение 10³, тогда сопротивление равно 1,23 10³ = 1230 Ом.

ЗАДАНИЕ 1. Определение диспесии сопротивления (импеданса) и коэффициента поляризации животных и растительных тканей.

В качестве объекта берут мышцу лягушки и лист алоэ.

1.Вначале определяют сопротивление нормальных тканей на частотах 50 и 500 Гц; 1, 10, 50, 100, 500 КГц и 1 МГц.

2.3атем мышцу лягушки помещают в бокс с эфиром на 15 мин, лист алоэ - в фарфоровую чашку и прогревают на плитке в течение 15 - 20 мин снова измеряют сопротивление обработанных тканей при тех же частотах. Результаты заносят в таблицу.

3.Строят график дисперсии сопротивления для нормальных и обработанных животной и растительной тканей, откладывая по оси ординат величину сопротивления, а по оси абсцисс - логарифм частот.

4.Вычисляют коэффициент поляризации для нормальных и обработанных животной и растительной тканей по формуле: К = R 10⁴/R 10⁶.

5.Делают выводы.

Литература

1. Торнуев Ю.В. и др. Электрический импеданс биологических тканей, М, 1990 г.

2. Тарусов Б.Н. и др. Биофизика, М, 1968.

3. Губанов Н.И., Угепбергенов А.А. Медицинская биофизика, М. 1978.

ЛАБОРАТОРНАИ РАЫИА № 3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ ДИССОЦИЛ1 (ИИ И рК I ЯИ11И11Л ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Метод основан на свойстве электродов отвечать измененном электрического потенциала на изменение активности ионов в окружающей среде в соответствии с уравнением Нернста:

Е = Е0 + RT/nF In а (1)

где Е - потенциал измерительного электрода относительно некоторого электрода сравнения, а - активность иона в исследуемом растворе, п - заряд иона, Е0 -стандартный электродный потенциал, R - универсальная газовая постоянная, равная 8,3103 ДжК"1кмоль"' или 1,99 кап моль"'град'1, Т - абсолютная темпера­тура, F - число Фарадея, равное 9,6 10' Кул кг экв'1 или 23,07-103 кап В экв"'.

Активность иона а и концентрация С связаны простым соотношением:
а = у С (2)

где у - коэффицент активности, имеющий смысл меры отклонения свойств реального раствора от раствора идеального.При сильных разведениях раствора (малых концентрациях) у - 1, т.е. активность равна концентрации раствора.

Концентрацию ионов в растворе обычно выражают в виде показательной функции (например, С = 10"[1] моль л"1), поэтому для удобства натуральный логарифм активности в уравнении Нернста заменяют десятичным логарифмом активности с обратным знаком. Этот отрицательный десятичный логарифм активности иона в растворе называют ионным показателем и обозначают рН, если речь идет об ионах Н*, т.е.

рН = -lg ан+ - водородный показатель (3)

Для разбавленных растворов можно записать: рН = -lg [Н+], где [ Н*] - концентрация ионов Нк в растворе.Так, например, для раствора, в котором [Н+] = 10's моль л"1, величина рН = 5.

УДК 577

Малый практикум по биофизике: Методические разработки лабораторных работ /Сост. В.О.Крауз; В.А.Опритов; В.Г.Ретивин; В.А.Худяков. - Н.Новгород ННГУ, 1996. - 68 с.

В методических разработках представлены лабораторные работы малого практикума по биофизике для студентов, обучающихся по специальности "Биология".

Составители: доц.,канд.биол.наук В.О.Крауз, проф.,докт.биол.наук В.А.Опритов, доц.,канд.биол.наук В.Г.Ретивин, доц.,канд.биол.наук В.А.Худяков. Рецензенты: проф.,докт.биол.наук В.Н.Крылов, науч.сотр. Н.Н.Абрамова.

Нижегородский государственный университет им. Н.И.Лобачевского, 1996

Поиск по сайту: