АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

Определение активности ацетилхолинэстеразы в сыворотке крови

Читайте также:
  1. D. Определение звука в слове (начало, середина, конец слова)
  2. I Этап. Определение проблемы
  3. I.2. Определение расчетной длины и расчетной нагрузки на колонну
  4. III. Анализ изобразительно-выразительных средств, определение их роли в раскрытии идейного содержания произведения, выявлении авторской позиции.
  5. IV. Определение победителей.
  6. SDRAM: Определение
  7. Анализ активности вегетативной нервной системы
  8. Анализ деловой активности предприятия. Факторная модель Дюпон.
  9. Анализ колебаний экономической активности на основе модели IS-LM с фиксированными ценами.
  10. АНАЛИЗ КРОВИ №__7___
  11. АНАЛИЗ КРОВИ №__7___
  12. Анализ потенциала трудовой активности населения России

Принцип метода. Холинэстераза катализирует реакцию гидролиза ацетилхолина с образованием холина и уксусной кислоты. В результате изменяется рН буферного раствора, поэтому мерой активности фермента может быть изменение рН инкубационной среды.

Реактивы, исследуемый материал: 1) 3,5% ацетилхолин; 2) раствор мединала для калибровочной кривой (10,3 г мединала растворяют в 500 мл воды); 3) 0,1 М НС1; 4) веронал-мединаловый буфер, рН 8,4 (2,06 г мединала растворяют в 100 мл воды и 82,3 мл этого раствора смешивают с 17,7 мл 0,1 М раствора НС1); 5) 0,02% феноловый красный на 0,025 М НС1; 6) сыворотка крови.

Ход работы. В одну пробирку вносят 1 мл буферного раствора, 0,5 мл раствора ацетилхолина и 0,1 мл сыворотки, в другую – 1 мл буферного раствора, 0,5 мл воды, 0,1 мл сыворотки крови. Обе пробирки инкубируют 60 мин при 37°С. За 2-3 мин до окончания инкубации в обе пробирки добавляют по 3,5 мл воды и 0,1 мл раствора фенолового красного. Определяют оптическую плотность опытной и контрольной проб в кювете толщиной 10 мм при длине волны 536 нм (зелёный светофильтр).

Калибровочная кривая. Согласно таблице готовят ряд буферных растворов:

 

  Значение рН
7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6
Раствор мединала, мл 5,36 5,54 5,81 6,15 6,62 7,16 7,69 8,23 8,71
0,1М НСl, мл 4,64 4,46 4,19 3,85 3,38 2,84 2,31 1,77 1,29

К 10 мл каждого буферного раствора прибавляют по 0,1 мл раствора фенолового красного и определяют величины оптической плотности (как в опытных пробах). При построении калибровочного графика по оси ординат откладывают найденные величины оптической плотности, а по оси абсцисс — соответствующие значения рН раствора.

Активность ацетилхолинэстеразы оценивают согласно калибровке по величине изменения рН опытной пробы по сравнению с контрольной, а также в миллимолях уксусной кислоты на 1 л сыворотки за 1 ч инкубации. Реакция может быть остановлена добавлением прозерина.

 

Ферменты синтеза ацетилхолина и норадреналина находятся в постсинаптических окончаниях соответствующих нервных волокон, фермент распада ацетилхолина (холинэстераза) — на поверхности постсинаптической мембраны. Ацетилхолин в процессе инактивации распадается на составные части (ацетат и холин) – те самые, из которых происходит его синтез. Норадреналин не превращается в исходный тирозин, а подвергается модификации, следовательно, продукты его инактивации повторно не используются.

Ацетилхолин взаимодействует с рецепторами, а также с холинэстеразой; прозерин конкурирует за связывание ацетилхолина лишь с холинэстеразой. Поскольку прозерин — конкурентный ингибитор, то при повышении концентрации ацетилхолина действие его на холинэстеразу уменьшается. Фармакологический эффект прозерина (усиление парасимпатических реакций) при введении ацетилхолина не уменьшится. Сам прозерин вызывает накопление в синапсе ацетилхолина, который беспрепятственно действует на рецепторы. Дополнительное введение ацетилхолина, возможно, высвободит холинэстеразу, но не уменьшит концентрацию ацетилхолина и возбуждение рецепторов.


Поиск по сайту:



Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.003 сек.)