 |
АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция
ЗАНЯТИЕ 11. Тема:Генетика микроорганизмов
|
Читайте также: |
Тема: Генетика микроорганизмов. Медицинская биотехнология. Генетическая инженерия.
Студент должен знать:
- Фенотипическую и генотипическую изменчивость микроорганизмов.
- Мутации. Генетические рекомбинации у бактерии: трансформация, трансдукция, коньюгация.
- Плазмиды.
- Основные направления медицинской биотехнологии.
- Методы генетической и клеточной инженерии, их использование в диагностике и лечения; получение лечебных, профилактических и диагностических препаратов.
- Методы картирования генов.
Уметь:
- Поставить опыт и учесть результаты опытов трансдукции, трансформации, трансдукции.
- Владеть принципами молекулярной гибридизации, полимеразной цепной реакции, получение интерферона, инсулина методами генной инженерии и МКА с помощью гибридомной технологии.
Вопросы для проверки исходного уровня знаний
1. Организация генетического аппарата у бактерий. Бактериальная хромосома и плазмиды. Генотип и фенотип.
2. Мутации спонтанные и индуцированные. Каков молекулярный механизм мутаций? Какие вы знаете мутагены?
3. Что такое ауксотрофы? Как получают ауксотрофные штаммы бактерий?
4. Генетические рекомбинации. Что такое трансформация?
5. Трансдукция и какими свойствами обладает трансдукцирующий фаг? Трансдукция специфическая, неспецифическая, абортивная.
6. Что такое коньюгация бактерий? Как она осуществляется? Основные функции F -фактора.
7. Понятие о внехромосомных носителях генетической информации.ции. Плазмиды. Классы плазмид.
8. Типы генетического контроля лекарственной устойчивости у бактерий? Какими свойствами обладают R -плазмиды?
9. Что такое бактериоцины? Гены, детерминирующие бактериоциногенность. Каковы основные свойства Col- плазмид?
10. Основные направления развития медицинской биотехнологии.
11. Проблемы конструирования клетки с новыми свойствами. Селекция микроорганизмов-продуцентов биологически активных веществ.
12. Методы генетической инженерии. Получение интерферона, инсулина, гормона роста, интерлейкинов, субьединичных вакцин.
13. Принципы постановки и примеры использования методов МГ и ПЦР.
14. Клеточная инженерия. Гибридомная технология и получение МКА.
15. Способы картирования бактериальных хромосом и плазмид.
16. Проблемы создания новых лекарственных форм. Иммобилизации антибиотиков на липосомах.
Самостоятельная работа студентов
Задание 23. Рассмотреть S - и R -колонии на демонстрационных чашках.
Описание представить в альбомах.
Задание 24. Генетические рекомбинации у бактерий:
- Коньюгация: постановка опыта скрещивания Нfr x F у кишечной палочки. (Демонстрация).
- Специфическая трансдукция: постановка опыта передачи локуса " gal " с помощью умеренного фага «лямбда» у кишечной палочки. (Демонстрация).
- Трансформация: демонстрация опыта передачи устойчивости к стрептомицину у Bacillus subtilis.
- Плазмиды: демонстрация электронограмм различных плазмид.
- Результаты продемонстрированных опытов с описанием и объяснениями представить в альбомах.
Методические указания к выполнению работы
| Рассмотреть рост колоний биохимических мутантов на демонстрационных чашках. Ауксотрофные мутанты - биохимические мутанты, требующие присутствия в питательной среде факторов роста (аминокислот, витаминов), в которых не нуждаются клетки исходного (дикого) типа, называемые прототрофами. Прототрофыспособны размножаться на полноценных средах, но не могут расти на минимальных. Для того, чтобы ауксотрофный мутант размножался на минимальной среде, в нее должен быть добавлен фактор роста (или несколько различных факторов), в которых данный ауксотроф нуждается, поскольку сам не может синтезировать. Для получения ауксотрофных мутантов с помощью «пениициллинового» метода на исходную (прототрофную) культуру воздействуют мутагенными факторами - ультрафиолетовыми лучами или химическими мутагенами. Затем обработанную таким образом культуру выращивают в полноценной среде, в которой размножаются как прототрофные, так и ауксотрофные клетки. Размножившиеся бактериальные клетки отмывают и переносят в минимальную среду с добавлением пенициллина, где могут размножаться только клетки-прототрофы. Под действием пенициллина эти растущие клетки погибают. Ауксотрофные мутанты, не способные к делению на минимальной среде. Для проверки на ауксотрофность колонии высевают паралельно на минимальные и полноценные среды (удобно пользоваться методом «реплик»). Выделенные ауксотрофы идентифицируют, т.е. определяют необходимый фактор роста. |
| Генетические рекомбинации |
| Это обмен генетического материала мужду бактериями путем встраивания фрагмента хромосомы бактерии донора в хромосому бактерии рецепиента в процессе трансформации, трансдукции или коньюгации. Образующиеся рекомбинанты несут хромосому рецепиента, в которую включаются только отдельные фрагменты хромосомы донора (в этом существенное отличие от полового процесса эукариотов, потомство которых получает полных хромосомный набор обоих родителей). |
| 1. Конъюгация - передача генетического материала от бактерий доноров к реципиентам путем их непосредственного контакта. Поставить опыт коньюгации по передаче маркеров «pro», «thr»-«leu» в скрещивании типа Hfr x F у кишечной палочки, для этого в опыт берут: 1) E.coli с Hfr - донор с генотипом pro+, thr+, leu+, str чувствительный; 2) культуру-рецепиент с генотипом pro-, thr-, leu-,str thr - leu. Получение бактериальных культур. Суточные культуры пересевают на бульон и выращивают при хорошей аэрации в течение 3-х часов. Опыт коньюгации проводят в чашках с селективной средой – минимальным агаром с добавлением глюкозы и стрептомицина. Постановка опыта коньюгации 1. В опытную пробирку в отношении 1:10 вносят культуру донора (0,1 мл) и реципиента (0,9 мл). Скрещиваемую смесь инкубируют при 37 С в течение 30 минут. Этого времени достаточно для вхождения проксимальных маркеров pro, thr, leu. При необходимости передачи всех хромосомы смесь выдерживают 2 часа. 2. Ставят два контроля: донора и рецепиента. Обе культуры разводят в 100 раз (0,1 мл культуры + 9,9 л физиологического раствора) и высевают по 0,1 мл на чашки с селективной средой, на которой они расти не могут, т.к. культура-донор чувствительна к стрептомицину, а рецепиент является ауксотрофом. 3. После инкубации скрещиваемую смесь разводят на 100 раз физиологическим раствором и засевают в обьеме 0,1 мл на селективную среду, на которой будут расти только прототрофные рекомбинанты. Опыт коньюгации учитывают через 24-48 часов. На контрольных чашках роста быть не должно, на опытной чашке вырастут рекомбинанты, число которых подсчитывают. |
| 2. Трансдукция - перенос генетического материала от бактерий доноров к реципиентам с помощью трансдуцирующего фага. Различают неспецифическую (общую) трансдукцию и специфическую. При неспецифическую фаг (Р1, Р22) может включать различные фрагменты бактериальной хромосомы и передавать их клеткам-реципиентам, При специфической трансдукции возможен перенос только строго определенных генов. Специфически трансдуцирующим фагом является фаг «лямбда», который способен переносить гены «gal» и «bio». Опыт по передаче «gal» маркера кишечной палочке В опыт берут: 1) трансдуцирующий фаг «лямбда», выделенный из лизогенной культуры донора E.coli gal+ путем индукции УФ-светом; 2) культуру E.coli gal- реципиент. Опыт проводят на чашках с селективной средой, содержащей галактозу (среда ЭМС с индикатором эозин + метиленовый синий). Постановка опыта трансдукции 1) В опытную пробирку вносят 0,9 мл 3-часовой бульонной культуры-реципиента и 0,1 мл фаголизата трансдуцирующего фага «лямбда» в концентрации 10 частиц/мл (множественность инфекции 1,0). Смесь выдерживают при 37 0С в течение 30 минут. 2) Ставят 2 контроля: фаголизата на стерильность и культуры-реципиента, высевая их по 1,0 мл на чашки с селективной ЭМС-средой. 3) После инкубации делают высев 0,1 из опытной пробирки с трансдуцирующей смесью на чашку с селективной ЭМС-средой. Опыт учитывают через 48 часов. В контроле фаголизата рост должен отсутствовать. В контроле культуры-реципиента, не расщепляющей галактозу, микробы должны расти в виде бесцветных колоний. На опытной чашке вырастают окрашенные колонии трансдуктантов на фоне прозрачных, бесцветных колоний культуры-реципиента. |
| 3. Трансформация - изменение свойств бактерий реципиентов под влиянием ДНК, выделенной из бактерий доноров, то есть непосредственная передача фрагмента ДНК донора клетке-реципиенту. Учесть опыт передачи устойчивости к стрептомицину у Bacillus subtilis. В опыт были взяты: 1) ДНК, полученная из стрептомициноустойчивой культуры-донора; 2) стрептомициночувствительная культура-реципиент (в компетентном состоянии). Опыт поставлен на чашках с МПА, в который добавлен стрептомицин в количестве 100 ед/мл. Постановка опыта трансформации Культуру компетентных клеток соединяют в равных обьемах с ДНК (напри–мер, по 0,5 мл). Выдерживают смесь в термостате 30 минут для контакта, после чего проводят высев на чашки с МПА и стрептомицином - по 0,2 мл смеси. Ставят 2 контроля: 1) высев на чашку ДНК и 2) высев стрептомицино–чувствительной культуры-реципиента. Опыт учитывают через 24-48 часов. В обоих контролях рост должен отсутствовать, на опытных чашках вырастают колонии трансформантов, которые приобрели признак стрептомициночувствительности. 4. Плазмиды - внехромосомные генетические структуры бактерий, представляющие собой циркулярные молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Плазмиды располагаются в цитоплазме бактериальной клетки, некоторые могут включаться (интегрировать) в хромосому. |
Поиск по сайту: