Proovide ettevalmistamine ja sisestamine

Teoreetiline osa.

Geelkromatograafia on meetod erinevate suurustega molekulide eraldamiseks segust. Kolonni laetakse peeneteraline, võimalikult ühtlase poorsusega geel, kolonni alumisse otsa pannakse geeli mitte läbilaskev, kuid uuritavate ainete läbimist lubav takistus(klaasvill), mis lubab eraldada puhastatava aine geelist endast.

Molekulid, mis on liiga suured, et mahtuda geeli pooridesse, tulevad kolonnist läbi esimesena. Kõige väiksemad molekulid aga takistuvad pooridesse, ning väljuvad geelist viimastena. Et geel ära ei kuivaks, ning et ta maksimaalselt lahutaks, tuleb pärast proovi kolonni sisestamist pidevalt lisada elueerimisvedelikku, mis ise ei muuda katse tulemusi.

Läbi tulnud vedelik kogutakse 2ml fraktsioonidena katseklaasidesse, et neid saaks spektromeetriliselt analüüsida. Vastavalt fraktsiooni värvile mõõdetakse tema optiline tihedus kindlal lainepikkusel. Optiline tihedus määrab aine kontsentratsiooni.

Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud:

V_t – täidise maht

V_v – kolonni vaba maht (graanulitevahelise vedeliku maht)

V_s – graanulitesisese vedeliku maht

V_g – geelimaatriksi maht

V_t=V_v+V_s+V_g

Ainet iseloomustab elueerimismaht ehk väljumismaht V_x. See on eluaadi maht, mis on kogutud kuni aine maksimaalse kontsentratsiooniga fraktsiooni kolonnist väljumiseni.

Kui mingid segus olevad molekulid on liiga suured mahtumaks geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena, st neil on minimaalne elueerimismaht V_x^min, mis võrdub kolonni vaba mahuga. V_x^min = V_v

Ained, mille molekulid on piisavalt väiksed, et mahtuda täielikult geeli pooridesse väljumad maksimaalse elueerimismahuga V_x^max, mis on ligilähedane kolonni kogumahule V_x^max ≈V_t. Kromatografeerimise võib lugeda lõpetatuks, kui kolonni läbinud vedelikku maht ületab kolonni kogumahtu.

Töö käik.

Kolonni tätmine ja iseloomustamine

Geel: Sefadex 6-50

Täidetud kolonnile arvutatakse geelisamba kõrguse ja diameetri alusel täidise kogumaht V_t

Geelisamba kõrgus = 31cm

Sissediameeter = 2,0 cm

V_t = πr²h = 3,14*1²*31= 97,34 cm³

Vastavalt kolonni täitematerjalli iseloomustava teguri k väärtusele leitakse geelimatriksi maht V_g

k = 0.1

V_g = k*V_t = 0,1* 97,37 = 9,734 cm³

Geelimatriksi mahust lähtuvalt leiame antud kolonnile iseloomulik maksimaalne elueerimismaht V_x^max

V_x^{ma x} =V_t-V_g = 97.37 – 9,734 = 87,6= 88 cm³

Kui fraktsioonide mahuks võtta 2 ml, siis peaks kokku saama 88/2=44 fraktsiooni.

Kromatografeerimissüsteemi koostamine

Kolonni üleosa suletakse korgiga, mida läbib klaastoru. Kolonni hoidva statiivi külge kinnitakse kolonnist kõrgemale eluendi reservuaar ja ühendatakse kolonniga. Kontrollitakse, et reservuaaris oleks küllaldaselt vedelikku.

Avades kollondi ja eluendi resesrvuaari vahel oleva kraani ning seejarel kolonni väljavooluava, hakkab vedelik aeglaselt läbi kolonni voolama.

Proovide ettevalmistamine ja sisestamine

Uuritav segu koosnes kolmest ainest: Dekstraansinine, müoglobiin ja DNP-aspartaat, millest kõik ained on värvilised.

Proovi doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutasin süstalt. Süstal täidetakse prooviga ja viiakse kolonni, juhtides vooliku otsa läbi voolukihti umbes 5mm kaugusele geeli pinnast.

Поиск по сайту: