Сушильный шкаф

Холодильник.

Используется для хранения культур микроорганизмов, иммунобиологических препаратов.

Центрифуга.

Используется для разделения жидкостей с различной плотностью, для получения сыворотки крови, для разделения твердых тел от жидкостей.

Сушильный шкаф.

Имеет несколько температурных режимов. Применяется для сушки лабораторной посуды.

Бактериоскопический метод состоит в. изучении микроорганизмов под микроскопом. Исследованию могут подвергаться как микроорганизмы в живом состоянии, так и убитые окрашенные микробные клетки.

Методические указания:

Приготовление препаратов для микроскопического исследования.

Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой.

Петлю прокаливают в пламени спиртовки. Вращательным движением вынимают из пробирки пробку и обжигают край пробирки. Вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, захватывают материал. После приготовления препарата петлю прожигают в пламени спиртовки.

Приготовление фиксированных препаратов-мазков.

1.Для приготовления препарата подготавливают предметное стекло, обезжиривая его.

2.На обезжиренное предметное стекло наносят взвесь бактерий и равномерно распределяют ее по поверхности стекла.

3.Мазок высушивают на воздухе или в пламени спиртовки.

4.Высушенные мазки подвергают фиксации, в результате которой бактерии погибают и прикрепляются к поверхности стекла. Обычно для фиксации мазка предметное стекло проводят несколько раз через пламя горелки. Иногда мазки фиксируют химическим способом (спиртами, смесью Никифорова и т.д.).

Этапы приготовления фиксированного мазка:

1.Подготовка предметного стекла

2.Приготовление мазка

3.Высушивание микропрепарата

4.Фиксация микропрепарата

Окраска препарата простым способом.

1.Фиксированный мазок помещают на «салазки» в кювету, дают ему остыть.

2.Наносят на него пипеткой несколько капель красителя на 2-3 мин.

3.Смывают краситель водой.

4. Высушивают препарат фильтровальной бумагой.

Морфология бактерий – размер, форма и взаимное расположение бактериальных клеток

Схема описания морфологии бактерий в мазке:

1. Форма

2. Размеры

3. Характер концов (для палочек)

4. Взаиморасположение

Приготовление нативных препаратов для прижизненного изучения микроорганизмов.

Метод «висячей» капли.

1. На покровное стекло наносят каплю исследуемого материала.

2. Предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так. Чтобы капля находилась в центре лунки.

3. Переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В готовом препарате капля должна висеть над лункой, не касаясь ее дна.

Для микроскопии вначале используют объектив малого увеличения, находят край капли, а затем устанавливают иммерсионный объектив и исследуют препарат, определяя подвижность микроорганизмов.

Метод «раздавленной» капли.

На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала и покрывают ее покровным стеклом. Капля не должна выходить за пределы покровного стекла. Раздавленную или висячую каплю, микроскопируют с помощью с иммерсионной систе­мы в затемненном поле зрения — при суженной диафрагме и опущенном конденсоре.

Рекомендуется их микроскопировать в микроскопе с темным полем зрения.

Контрольные вопросы:

1. Что изучает медицинская микробиология?

2. Какие виды лабораторий существуют?

3. Назовите основные виды микроскопов, используемых для работы различных лабораторий.

4. Что такое морфология бактерий?

5. Назовите основные морфологические формы бактерий.

6. Почему разрешающая способность иммерсионного объектива выше, чем сухого?

7. Назовите этапы приготовления мазка для иммерсионной микроскопии.

8. Для чего необходима фиксация мазка?

9. Какова последовательность простой окраски препарата микроорганизмов?

Д. З. Заполнить таблицу:

Отличительные черты прокариот от эукариот

Список литературы:

Обязательная:

1.Борисов Л.Б,, Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология, М., Медицина. 1994 г.

2.Борисов Л.Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1997 г.

3.Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.

4.Коротяев А.И., Бабичев С.А. СпецЛит. 2000 г.

Дополнительная:

1. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М.,1974 г.

2. Тимаков В.Д., Левашов В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. М. 1983 г.

3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., 1982 г.

Занятие № 2 Морфология бактерий. Тинкториальные свойства бактерий. Окраска по методу Грама.

Цель: Научиться окрашивать мазки по методу Грама и изучать морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов

Знать: Особенности морфологии бактериальных клеток. Методику окрашивания по методу Грама.

Уметь: Приготовить мазок, окрасить его, осуществить микроскопию с помощью иммерсионного микроскопа, описать морфологию и отдельные особенности ультраструктуры клеток бактерий.

Обоснование темы: Морфология бактериальной клетки имеет важное значение для классификации бактерий и используется для бактериоскопического метода диагностики некоторых инфекционных заболеваний

Вопросы для самоподготовки:

1. Основные морфологические группы бактерий.

2. Особенности морфологии грибов, актиномицетов, риккетсий, спирохет, микоплазм и хламидий.

3. Понятие о простых и сложных методах окраски.

4. Выявление различий в строении клеточной стенки бактерий с помощью окраски по Граму.

ПЛАН

Программа:

1. Морфология бактериальных клеток.

2. Дифференциация бактерий с помощью окраски по методу Грама

3. Основные отличительные черты простых и сложных методов окрашивания.

Демонстрация:

1. Мазок из смеси бактерий (окраска по методу Грама)

2. Мазки различных морфологических форм микроорганизмов.

Задание студентам:

1. Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в готовом препарате из смеси бактерий (окраска по методу Грама). Зарисовать.

2. Самостоятельно приготовить мазки из культур кишечной палочки и стфилококка, окрасить по методу Грама, микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.

3. Микроскопировать и зарисовать мазки различных морфологических форм бактерий. Заполнить таблицу:

Основные морфологические формы бактерий

Информационный материал.

Морфологические формы бактерий

Известны четыре основные формы бактерий: шарообразная, палочковидная и извитая и нитевидная. В соответствии с этим все бактерии по форме подразделяются на следующие группы:

1) кокки (шарообразные),

2) бактерии (палочковидные),

3) спириллы (извитые в виде спирали)

4) актиномицеты (нитевидные)

1. Кокки — бактерии круглой формы, имеющие в диаметре 1—2 мкм. Они различаются между собой по взаимному расположению отдельных клеток, которое зависит от способа их деления. Если по окончании деления кокки разъединяются на отдельные шарики, получается форма микрококка. Группа из двух кокков носит название диплококка. Если деление кокков происходит в одном направ­лении и образующиеся кокки не разъединяются, то получается цепочка из шариков. Эта форма носит название стрептококка.При делении в двух взаимно перпендикулярных направлениях возникают сочетания по четыре кокка — тетракокка.

Если деление происходит в трех взаимно перпендикулярных направлениях, кокки соединяются в виде объемных пакетов и получают название сарцин.

Если кокки образуют скопления клеток в виде виноградных гроздьев, они называются стафилококками.

Кроме того, кокки могут иметь правильную круглую форму, овальную форму, ланцетовидную форму, бобовидную форму.

2. Бактерии – имеют палочковидную форму размером от нескольких долей микрона до 1—5 мкм (различают короткие, длинные, тонкие и толстые палочки). Они различаются друг от друга наличием споры, ее диаметром, формой концов и т.д. Бациллами называют палочки, которые способны образовывать споры, не превышающие в диаметре клетку. Клостридиями считают бактерии, способные к образованию спор, значительно превышающих диаметр бактериальной клетки. Палочки, не способные к спорообразованию, называются бактериями (в узком смысле этого слова).

Бывают палочки с закругленными концами, например, кишечная палочка, с обрезанными краями (палочка сибирской язвы); с заостренными краями (фузобактерии). У коринобактерий края палочек утолщены из-за наличия в них запасов валютина.

Палочки могут располагаются одиночно, по две бактерии (диплобациллы), в виде цепочек (стрептобациллы); некоторые палочки располагают­ся под углом (коринобактерии дифтерии).

3. Извитые формы. Если бактерия имеет один завиток спирали, она называется вибрионом (холерный вибрион). Длина вибрионов 1—3 мкм. Кампилобактерии имеют изгибы тела, напоминающие крылья летящей чайки.

Спириллы, спиралевидные, неподвижные микроорганизмы, имеющие более одного завитка, длиной от 5 до 30 мкм.

Спирохеты - подвижные, извитые формы микроорганизмов. Различают следующие разновидности спирохет: трепонемы имеют 8-12 завитков, симметричны; боррелии имеют 3-8 крупных завитка, не симметричны и лептоспиры, симметричные микроорганизмы имеющие более 10 мелких завитков и 2 крупных изгиба на концах клетки, напоминающие букву S или C.

Методические указания:

Сложные методы окраски используют для выявления различных компонентов бактериальных клеток и для дифференциации бактерий в зависимости от химического состава и ультраструктуры. Для сложных методов окрашивания в отличии от простых используется не менее двух различных красителей, один из которых является основным а другой дополнительным.

Окраска по методу Грама:

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель – генциановый фиолетовый через полоску фильтровальной бумаги. Выдержать 2 мин.

2. Не промывая мазок, нанести раствор Люголя на 1 мин.

3. Обесцветить этиловым спиртом 5-10 сек.

4. Промыть водой.

5. Нанести раствор водного фуксина на 1-2 мин.

6. Промыть водой, высушить.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные в красный. Принцип метода заключается в том что генциановый фиолетовый связывается с пептидогликаном клеточной стенки. Толстый слой пептидогликана грамположительных бактерий связывает много красителя. Тонкий слой – грамотрицательных – мало. Раствор Люголя фиксирует краситель за счет образования комплекса краситель-пептидогликан-йод. При обработке мазка спиртом грамотрицательные микроорганизмы быстро теряют краситель и обесцвечиваются. А грамположительные микрооганизмы остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Дополнительный краситель окрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет.

Окраска по Граму имеет дифференциально-диагностическое значение. К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки и др., к грамотрицательным – гонококки, кишечная палочка, менингококки и др. Некоторые виды окрашиваются по Граму вариабельно в зависимости от различных внешних и внутренних факторов.

Для правильной окраски следует соблюдать технику окрашивания.

Контрольные вопросы:

1.Назовите основные морфологические формы бактерий.

2 Каково строение клеточной стенки бактериальной клетки?

3.Каковы основные отличительные признаки Гр(-) и Гр(+) микроорганизмов?

4. Каково значение сложных методов окрашивания при диагностике инфекционных заболеваний?

5. Назовите последовательность операций при окраске микроорганизмов по методу Грама.

Д.З. Заполнить таблицу

Структура бактериальной клетки

Список литературы:

Обязательная:

1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.

3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г

4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.

2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974.

3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.

Занятие № 3 Строение бактериальной клетки. Сложные методы окраски.

Цель: Изучить строение бактериальной клетки, функции и методы выявления отдельных органоидов. Научиться окрашивать мазки по методу Циля-Нильсена, Бурри и Бурри-Гинса, Нейссера, Ожешко.

Знать: Особенности морфологии и ультраструктуры бактериальных клеток.

Уметь: Приготовить мазок, окрасить его сложным методом, осуществить микроскопию с помощью иммерсионного микроскопа, описать морфологию и отдельные особенности ультраструктуры клеток бактерий.

Обоснование темы: Строение бактериальной клетки имеет важное значение для классификации бактерий и используется для бактериоскопического метода диагностики некоторых инфекционных заболеваний

Вопросы для самоподготовки:

1. Отличительные черты клеток прокариотов от клеток эукариотов.

2. Облигатные компоненты клеток прокариотов

3. Факультативные компоненты клеток прокариотов.

4. Методы изучения структуры бактериальных клеток и их практическое значение.

5. Бактериоскопический метод диагностики. Его достоинства и недостатки.

ПЛАН

Программа:

1. Ультраструктура бактериальных клеток

2. Дифференциация бактерий с помощью окраски по методу Грама

3. Сложные методы окраски (методы Ожешко, Циля-Нильсена, Бурри-Гинса, Нейссера)

Демонстрация:

1. Капсула бактерий (окраска по методу Бурри-Гинса)

2. Кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза в мокроте (окраска по методу Циля-Нильсена)

3. Спорообразующие бактерии (окраска по методу Ожешки)

4. Зерна волютина у коринебактерий дифтерии (окраска по методу Нейссера)

Задание студентам:

1. Микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическим и тинкториальным свойствам в готовом препарате (окраска по методу Грама). Зарисовать.

2. Самостоятельно приготовить мазки из культур кишечной палочки и стфилококка, окрасить по методу Грама, микроскопировать и дифференцировать бактерии по морфологическм признакам и тинкториальным свойствам. Зарисовать.

4. Микроскопировать и зарисовать:

- капсулы клебсиелл (окраска по методу Бурри и Бурри-Гинса)

- коринебактерии дифтерии, содержащие зерна валютина (окраска по методу Нейссера)

- кислотоустойчивые микобактерии (окраска по методу Циля-Нильсена)

- споры бацилл сибирской язвы (окраска по методу Ожешки)

Информационный материал.

Сложные методы окраски используют для выявления различных компонентов бактериальных клеток и для дифференциации бактерий в зависимости от химического состава и ультраструктуры. Для сложных методов окрашивания в отличии от простых используется не менее двух различных красителей, один из которых является основным а другой дополнительным.

В бактериальной клетке имеются облигатные органоиды, к которым относят клеточную стенку, цитоплазматическую мембрану, цитоплазму, нуклеоид, рибосомы, мезосомы и факультативные органоиды: капсула, жгутики, фимбрии, пили, споры, плазмиды, включения.

Нуклеоид бактерий представлен двунитчатой ДНК, замкнутой в кольцо и расположен в центре клетки. Основными отличительными чертами ядерной субстанции бактерий от эукариотических клеток являются:

1. Отсутствие ядерной оболочки

2. Отсутствие ядрышка

3. Отсутствие гистонов

Для обнаружения бактериального ядра необходимо применение электронной микроскопии или применение окраски по способу Фельгена или по Романовскому-Гимза.

Цитотоплазма бактерий состоит из растворимых белков. Рибосомы бактерий состоят из двух субъединиц и имеют коэффициент седиментации 70S. В циотоплазме некоторых бактерий имеются запасы питательных веществ в виде включений, которые можно обнаружить при помощи различных методов окрашивания. Например, в цитоплазме у С. diphtheriae присутствуют зерна волютина, они являются включениями фосфатов и имеют в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию. Для выявления зерен волютина применяют окраску по методу Нейссера.

Клеточная стенка бактерий придает им определенную форму, участвует в процессах обмена веществ и деления клетки.

У бактерий можно выявить присутствие клеточной стенки с помощью электронной микроскопии, при окрашивании по методу Грама, Циля-Нильсена.

Клеточная стенка грамположительных бактерий значительно толще, чем у грамотрицательных, в ней содержится значительное количество пептидогликана (40-90%) связанного с тейхоевыми кислотами. У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана не превышает 10%.

Цитоплазматическая мембрана участвует в регуляции осмотического давления, в процессах обмена и транспорта веществ. Она окружает наружнюю часть цитоплазмы и состоит из двойного слоя липидов со встроенными поверхностными и интегральными белками. Цитоплазма способна образовывать особые впячивания, которые получили название мезосом. Мезосомы принимают участие в делении клетки, в процессе спорообразования, в синтезе некоторых веществ.

Капсула расположена снаружи клеточной стенки, представляет собой слизистое образование, состоящее из полисахаридов или полипептидов. Она имеет защитное значение, у патогенных бактерий капсула образуется чаще всего внутри организма человека или животного и препятствует фагоцитозу, повышает устойчивость к действию антител.

Некоторые бактерии (например, клебсиеллы, псевдомонады) образуют капсулу и в организме больного, и на питательной среде, где они дают крупные, слизистые колонии.

Капсула выявляется при специальных методах окраски.

Споры образуются при неблагоприятных условиях внешней среды (Вас. аnthracis, С. tetani). Спорообразование способствует сохранению вида и не является способом размножения. У клостридий спора превышает диаметр клетки, у бацилл – нет. Форма спор может быть овальной или округлой. У С. Tetani споры расположены терминально, для Вас. Аnthracis характерно центральное расположение спор. Споры химически инертны, поэтому окрашиваются с трудом. Для выявления этих структур используют окраску по методу Ожешки.

Жгутики имеются у подвижных бактерий. Они состоят из белка флагеллина. Оределение подвижности бактерий имеет диагностическое значение. По числу жгутиков и их расположению бактерии делятся на монотрихи, имеющие один жгутик, лофотрихи с пуч­ком жгутиков на одном конце клетки, амфитрихи имеют жгутики на обоих концах, и перитрихи, у которых жгутики расположены вокруг тела.

Жгутики можно обнаружить при электронной микроскопии после обработки тяжелыми металлами или в световом микроскопе после окраски по методу Леффлера, серебрения по Морозову.

Фимбрии и пили представляют собой нитевидные образования, расположенные на поверхности бактериальной клетки, состоящие из белка пилина. Существует несколько разновидностей фимбрий, которые отличаются друг от друга по выполняемым функциям: адгезия, питание, водно-солевой обмен. Пили участвуют в процессе конъюгации и образуются мужскими клетками-донорами.

Бактериоскопический метод диагностики основан на выявлении возбудителей инфекционных заболеваний в исследуемом материале по морфологическим, тинкториальным свойствам по взаимному расположению с применением различных методов окраски или в нативном состоянии.

Сфера применения: метод используется для диагностики заболеваний, возбудители которых обладают характерными морфологическим, тинкториальными, свойствами и типичной локализацией в организме, Например: гонорея, сифилис, возвратный тиф, туберкулез, некоторых микозы.

К достоинствам метода относятся быстрота, доступность, экономичность. К недостаткам метода относятся недостаточная информативность, низкая чувствительность, невозможность дифференциации внутри вида.

Методические указания:

Для выявления зерен волютина применяют окраску по методу Нейссера.

Окраска зерен волютина по методу Нейссера:

1. На фиксированный мазок нанести уксуснокислый метиленовый синий Нейссера на 2-3 мин.

2. Промыть водой.

3. Нанести дополнительный краситель - везувин.

4. Промыть водой, высушить.

При окраске образуется нерастворимый в воде комплекс: краситель-валютин. При промывке водой тело микробной клетки обесцвечивается, а гранулы валютина сохраняют синюю окраску. Тело клетки затем окрашивается везувином в желтый цвет.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена:

1. На фиксированный мазок нанести нанести фильтровальную бумагу, пропитанную карболовым фуксином Циля и прогреть в течение 3-5 мин.

2. Промыть водой.

3. Нанести 5% раствор серной кислоты на 1-2 мин для обесцвечивания.

4. Промыть водой.

5. Докрасить мазок раствором метиленового синего 3-5 мин.

6. Промыть водой, высушить.

В основе метода лежат разрыхление клеточной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кислотоустойчивые бактерии отличаются высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии окрашиваются дополнительным красителем.

Окраска капсул по методу Бурри-Гинса:

1. Смешать каплю взвеси микробных клеток с каплей туши и при помощи стекла сделать мазок.

2. На мазок нанести водный раствор фуксина на 1-2 мин.

3. Промыть водой, высушить.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы не окрашиваются и остаются прозрачными на темном фоне туши.

Окраска спор по методу Ожешко:

1. Протравливание мазка 0,5 % раствором соляной кислоты 2-3 мин при нагревании.

2. Промыть водой.

3. Окрасить по методу Циля-Нильсена.

Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты в качестве протравы, разрыхляющей оболочку споры, которая плохо воспринимает красители. В результате окрашивания споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.

Контрольные вопросы:

1. Какое строение и функции имеет нуклеоид бактериальной клетки?

2. Какое значение в жизни бактерий имеют плазмиды?

3. Каково строение спор бактерий?

4. Назовите последовательность операций при окраске микроорганизмов по методу Циля-Нильсена, Бурри, Ожешки, Нейссера.

5. С помощью какого метода окраски возможно обнаружить капсулы у бактерий?

Список литературы:

Обязательная:

1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.

3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г

4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.

2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974.

3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.

Занятие № 4 Физиология микроорганизмов.Бактериологический метод диагностики.питание бактерий. Питательные среды. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

Цель: Научиться выделять чистую культуру микроорганизмов, учитывать рост микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах.

Знать: Схему бактериального метода диагностики инфекционных заболеваний, особенности и классификацию питательных сред, особенности питания бактерий.

Уметь: Описывать культуральные свойства микроорганизмов, выделять чистые культуры с помощью механических методов.

Обоснование темы: Бактериологический метод является основным методом диагностики инфекционных заболеваний, для его постановки необходимы сведения о основных питательных потребностях бактерий и условиях их культивирования.

Вопросы для самоподготовки:

1. Особенности бактериологического метода диагностики, его достоинства и недостатки.

2. Питание бактерий. Потребности в питательных веществах.

3.Требования, предъявляемые к питательным средам.

4. Классификация питательных сред.

5. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

ПЛАН

Программа:

1. Метаболизм аэробных и анаэробных бактерий.

2. Питательные среды, применяемые для культивирования.

3. Понятие о чистой культуре и методы ее выделения.

Демонстрация:

1. Готовые питательные среды: мясо-пептонный агар, мясо-пептонный бульон, среда Эндо, желточно-солевой агар, солевой бульон, селенитовый бульон, среда Плоскирева.

2. Техника посева исследуемого материала петлей и шпателем на чашку Петри с плотной питательной средой с целью получения изолированных колоний.

Задание студентам:

1.Ознакомиться с питательными средами, их назначением: мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА), среда Эндо, среда Плоскирева, желточно-солевой агар ЖСА, солевой бульон (СА) селенитовый бульон и основными инградиентами для их изготовления.

2. Описать характер роста микроорганизмов на плотной питательной среде, оценить культуральные свойства бактерий

3.Описать характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах.

4. Выполнить 1 этап выделения чистой культуры аэробов из исследуемого материала и наметить ход дальнейшего исследования. Осуществить посев инокулята по методу Дригальского. Осуществить посев инокулята истощающим штрихом.

6. Заполнить таблицу. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

Информационный материал.

Основные среды:

Пептонный бульон. Выпускается в сухом виде, состоит из триптического гидролизата кильки хлорида натрия.

Питательный агар. Состав: ферментативный гидролизат кормовых дрожжей, агар, хлорид натрия.

Элективные питательные среды.

Желточно-солевой агар. Содержит 8-10% хлорида натрия, который не препятствует росту стафилококков и питательную основу с лецитином, при расщеплении которого вокруг колоний образуется перламутровый венчик преципитата.

Дифферинциально-диагностические среды.

Среда Эндо - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к дифференциально-диагностическим. Применяется для посева и выделения энтеробактерий. До посева имеет розоватый цвет.

Состав: МПА - питательная основа; лактоза - дифференциальный фактор; фуксин, нейтрализованный гипосульфитом - индикатор на РН.

Принцип работы среды - если выросшие микроорганизмы расщепляют лактозу, среда закисляется, РН меняется в кислую сторону, колонии будут окрашенными в тёмнокрасный цвет иногда с металлическим блеском. Так выглядят на этой среде колонии кишечной палочки. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.

Среда Плоскирева - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения патогенных энтеробактерий. До посева имеет цвет обычного МПА.

Состав: МПА - питательная основа; соли желчных кислот - элективный фактор; лактоза - дифференциальный фактор; нейтральный красный - индикатор на РН.

Принцип работы среды - соли желчных кислот подавляют рост непатогенных энтеробактерий (они могут расти на этой среде, но не через 24 часа, а позже - через 48); если микробы расщепляют лактозу, колонии будут окрашены в красный цвет. Шигеллы, сальмонеллы не расщепляют лактозу и поэтому их колонии окрашены в цвет среды.

Среда ЖСА (желточно-солевой агар) - плотная, сложная питательная среда, по классификации сред относится к элективно-дифференциальным. Применяется для выделения стафилококков.

Состав: МПА - питательная основа; 10% NaCl - элективный фактор; лецитин куриного желтка – дифференциальный фактор.

Принцип работы среды - 10% NaCl подавляют рост других микробов, поэтому на ней вырастают преимущественно стафилококки; если стафилококки продуцируют фермент лецитовителлазу, расщепляющий лецитин, вокруг таких колоний появляется зона помутнения. Чаще всего так выглядят на ЖСА колонии Staphylococcus aureus.

Требования к питательным средам:

1. Среды должны быть питательными, т.е. содержать все необходимые для жизнедеятельности вещества: источники азота, углерода, водорода и кислорода, минеральные соли, факторы роста для ауксотрофных микроорганизмов.

2. Среды должны быть изотоничными, т.е. осмотическое давление в среде должно быть таким же как и внутри клетки, для чего в среду добавляют 0,5 % NaCl.

3. Среды должны быть стерильными для обеспечения возможности выделения чистой культуры

4. Среды должны содержать достаточное количество доступной воды т.к. бактерии питаются по законам осмоса и диффузии.

5. Среды должны обладать определенным ОВП, т.е. соотношением веществ, отдающих и принимающих.

6. Среды должны быть прозрачными – удобнее следить за ростом культур.

7. Среды должны быть по возможности унифицированными по содержанию основных компонентов: содержание аминного азота, общего азота, содержание хлоридов, пептона.

Культуральные свойства микроорганизмов – особенности роста микроорганизмов на плотной питательной среде.

Бактериологический метод – основной метод диагностики инфекционных заболеваний. Включает в себя посев исследуемого материала на питательные среды, выделении чистой культуры и ее идентификацию(посев на плотные питательные среды, на жидкие питательные среды, определение морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, свойств, чувствительности к антибиотикам, количества микроорганизмов в исследуемом материале – определение вида и штамма микроорганизма.)

Выделение чистой культуры основа бактериологической работы, т. к. в процессе деятельности приходится иметь дело с материалом, содержащим смесь микроорганизмов, а идентификация вида возможна тогда, когда бактерии получены в чистом, изолированном виде.

Для получения чистой культуры необходимо отделить клетки разных видов друг от друга. По способу их отделения различают две основных группы методов выделения чистых культур:

1. Методы, основанные на механическом разделении.

2. Методы, основанные на различиях в биологических свойствах.

Чаще всего используют механические способы разъединения бактериальных клеток - специальные методы посева.

Техника посева материала на плотную питательную среду.

Получение изолированных колоний. Образование изолированных колоний достигается путем механического распределения микробов при посеве. Существует несколько способов посева материала.

Посев по методу Дригальского производится шпателем в чашку Петри на плотную питательную среду. Предварительно в центр среды петлей вносят каплю исследуемой культуры, а затем растирают по всей поверхности с помощью стерильного шпателя.

Посев истощающим штрихом производят петлей, предварительно разделив чашку Пери на 4 равных квадрата. Посев начинают с 1 квадрата параллельными штрихами и заканчивают в 4 квадрате.

Получение сливного роста можно использовать для накопления полученной культуры. В пробирку со скошенным агаром вносят петлю с материалом и производят посев зигзагом, двигаясь снизу вверх.

Ко второй группе методов получения чистых культур микроорганизмов относятся:

а) фильтрация. Исследуемый материал пропускают через специальные фильтры с определенным диаметром пор и таким образом разделяют микроорганизмы по величине (например, для очистки вирусов от бактерий)

Биологические методы выделения основаны на различиях в биологических свойствах микроорганизмов.

а) метод Шукевича – исследуемый материал засевают в конденсационную воду скошенного агара, при этом подвижные формы микроорганизмов при размножении «выползают» на поверхность агара из конденсационной воды (Proteus vulgaris).Отсевая верхний край культуры в воду свежескошенного агара и повторяя эту манипуляцию несколько раз, можно получить чистую культуру.

б) метод прогревания – прогревают материал до 80⁰С на водяной бане 10-15 мин., при этом вегетативные формы погибают, а споры остаются и при посеве на питательную среду прорастают (метод позволяет отделить споровые культуры от неспоровых)

в) метод охлаждения – выращивание микроорганизмов при низких температурах. Применяют для выделения чистых культур психрофильных бактерий (микроорганизмы рода Yersinia выращивают при температуре 5⁰ С)

г) бактериостатический метод при посеве в исходный материал добавляют некоторые химические вещества или антибиотики, которые угнетают рост одних микроорганизмов, не влияя на других (пенициллин задерживает рост Гр+ микроорганизмов, не влияя на ГР-, 5% Н₂SO₄ убивает большинство микроорганизмов, исключая кислотоустойчивых (возбудитель туберкулеза)

д) метод обогащения посев на элективные среды

е) заражение лабораторных животных.

Методические указания:

Схема описания культуральных свойств микроорганизмов:

1.Форма колонии

2.Размер колонии

3.Цвет

4.Характер края

5.Характер поверхности

6. Консистенция

Посев по методу Дригальского.

1.Подготовить 3 чашки Петри со стерильной питательной средой.

2. В центр среды петлей вносят 1 каплю исследуемой культуры.

3. Равномерно растирают каплю шпателем по поверхности питательной среды в чашке Петри.

4. Не обжигая шпателя, переносят материал последовательно во вторуюи третью чашки Петри.

На третьей чашке Петри после инкубации должны вырасти изолированные колонии микроорганизмов.

Посев истощающим штрихом.

1.Подготовить чашку Петри со стерильной питательной средой.

2. Разделить чашку Пери на 4 равных квадрата.

3. Посев производят петлей, начинают с 1 квадрата параллельными штрихами и заканчивают в 4 квадрате.

Таблица. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

Схема бактериологического метода лабораторной диагностики

Исследуемый материал

I этап (нативный материал): Микроскопия.

Посев на среды обогащения или на плотные питательные среды

II этап (изолированные колонии): Изучение культуральных, тинкториальных и морфологических свойств. Посев на скошенный питательный агар для выделение чистой культуры

III этап (чистая культура): Идентификация выделенной культуры.

Заключение о выделенной культуре

Контрольные вопросы:

1.Для чего предназначены питательные среды и каковы основные требования к ним?

2. Какие элективные среды Вам известны? Назовите их состав.

3. Какие методы применяются для выделения чистых культур микроорганизмов?

4. Почему бактериологический метод диагностики является основным при диагностике инфекционных заболеваний?

5. Назовите основную схему бактериологического исследования.

6.Чем определяется длительность бактериологического исследования?

Список литературы:

Обязательная:

1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.

3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г

4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.

2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974.

3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.

Занятие № 5 Физиология микроорганизмов. Биохимические свойства микроорганизмов.

Цель: Научиться определять чистоту выделенной культуры, делать пересевы петлей, учитывать результаты определения биохимических свойств бактерий.

Знать: Схему бактериального метода диагностики инфекционных заболеваний, способы поступления питательных веществ в бактериальную клетку, особенности обмена веществ бактериальной клетки, классификацию и функции ферментов, методы идентификации микроорганизмов.

Уметь: Описывать биохимические свойства бактерий и осуществлять пересевы для получения чистой культуры микроорганизмов и распознавания их биохимических свойств.

Обоснование темы: Изучение биохимических свойств микроорганизмов проводится с целью идентификации микроорганизмов, что является основным звеном в диагностике инфекционных заболеваний

Вопросы для самоподготовки:

1. Пластический и энергетический обмен

2. Питание бактерий Способы поступления питательных веществ в бактериальную клетку. Пермеазы.

2.Ферменты бактериальной клетки.

3. Идентификация и внутривидовое типирование.

4. Способы изучения биохимических свойств бактериальной клетки.

ПЛАН

Программа:

1. Особенности обмена веществ бактериальной клетки.

2. Идентификация бактерий.

3. Изучение биохимических свойств микроорганизмов.

Демонстрация:

1. Незасеянный «пестрый ряд».

2.Варианты изменения «пестрого ряда».

3. Незасеянная и измененная среда Клиглера.

4.Среда Симмонса.

5.СИБы.

6 Микрометод изучения биохимических свойств бактерий. Пластинки для идентификации.

Задание студентам:

1.Изучить состав, назначение и внешний вид сред Гисса. Зарисовать варианты изменения «пестрого ряда». Определить биохимическую активность различных микроорганизмов по средам Гисса.

2. Оценить результаты отсева чистой культуры: отметить характер роста и присутствие посторонних бактерий.

3.Убедится в чистоте выделенной культуры методом микроскопии окрашенного по Граму мазка.

4. Поставить каталазную пробу на предметном стекле.

5. Учесть результаты определения биохимической активности выделенных чистых культур на среде Клиглера.

6.Осуществить посев материала на скошенный МПА для получения чистой культуры

Информационный материал.

Обмен веществ (метаболизм) - совокупность процессов превращения веществ и энергии, направленных на сохранение и воспроизведение жизни.

Уровень метаболизма микробной клетки выше, чем у других организмов. Обмен веществ объединяет два процесса: пластический обмен (анаболизм, ассимиляция) и энергетический обмен (катаболизм, диссимиляция,).

Пластический обмен – это конструктивный метаболизм, при котором происходят реакции синтеза молекул клетки микроорганизма, обеспечивает усвоение веществ из окружающей среды, используемых для построения клеточных структур.Эта работа требует энергии, которую клетки получают в результате энергетического обмена.

Энергетический обмен – расщепление питательных веществ (белков, углеводов, липидов и др.). Эти процессы могут происходить в аэробных или анаэробных условиях. Катаболизм и анаболизм взаимосвязаны.

У микробной клетки соотношение поверхности к массе очень высоко по сравнению с другими организмами. Микробные клетки обладают огромным набором ферментов.

Биохимическая идентификация.

. Для оценки биохимической активности бактерий используют следующие реакции:

Ферментацию – неполное расщепление субстрата до промежуточных продуктов.

Окисление- полное расщепление субстрата до углекислого газа и воды.

Утилизацию – использование субстрата для роста.

Диссимиляцию субстрата.

Гидролиз субстрата.

Традиционный метод идентификации по биохимическим свойствам заключается в посеве чистой культуры на дифференциально-диагностические среды, содержащие определенные субстраты, с целью оценки способности микроорганизма ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма.

Определение сахаролитической активности.

1. Определение биохимической активности с помощью посева на среды «пестрого ряда». Короткий «пестрый ряд» включает жидкие среды Гиса с моно- и дисахаридами, глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. В длинный «пестрый ряд» кроме перечисленного входят среды с арабинозой, ксилозой, галактозой, глицерином и т. д. Для оценки способности бактерий ферментировать углевод в среды добавляют индикатор Андреде, позволяющий выявить образование кислых продуктов расщепления и «поплавок» для обнаружения газа.

2. Определение биохимической активности на среде Клиглера. Среда Клиглера предназначена для определения ферментации глюкозы, лактозы, выделения сероводорода и выделения газа. Разливается в пробирки и скашивается наполовину. Незасеянная среда Клиглера имеет красный цвет. Если после инкубации скошенная часть среды меняет цвет с красного на желтый, происходит ферментация лактозы, если столбик агара меняет цвет с красного на желтый – происходит ферментация глюкозы. Если в столбике агара наблюдается почернение – выделяется сероводород и происходит ферментация глюкозы. Если в среде наблюдаются пузырьки газа, следовательно в процессе ферментации выделяется газ.

Определение протеолитических свойств микроорганизмов.

Для определения протеолитических ферментов производят посев культуры на мясо-пептонную желатину, которую инкубируют при комнатной температуре несколько дней. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин.

При разрушении белков может выделятся аммиак, индол или сероводород.

Реакция на аммиак. Применяют полоску фильтровальной бумаги пропитанной индикатором. При положительном результате бумага синеет.

Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с культурой бактерий добавляют несколько капель реактива Эрлиха. В присутствии индола на поверхности появляется розовое кольцо.

Реакция на сероводород. Можно использовать фильтровальную бумагу с сульфатом железа. При выделении сероводорода бумага окрашивается в черный цвет.

Обнаружение каталазы. На предметное стекло наносят 1-2 капли раствора пероксида водорода и вносят нее петлю с исследуемой культурой. Выделение пузырьков газа свидетельствует о наличии каталазы.

Определение биохимической активности микроорганизмов с использованием Системы индикаторных бумаг (СИБы)

Принцип действия: диски из фильтровальной бумаги, пропитанные питательными средами (питательная среда + субстрат+индикатор) и высушенные, хранятся во флаконах. В лаборатории диски раскладываются в стерильные пробирки и заливаются суспензией исследуемой культуры в физрастворе. Учет проводят после 18-24 часовой инкубации в термостате по изменению цвета индикатора.

Определение биохимической активности микроорганизмов с использованием Панелей биохимической идентификации.

Принцип действия: в лунках специальных пластиковых панелей находятся соответствующие высушенные среды (питательная основа+субстрат+индикатор). В лаборатории в лунки вносят суспензию исследуемой культуры и после инкубации (5-24 часа) учитывают результат по изменению цвета индикатора.

Примеры: Панель биохимической дифференцировки энтеробактерий, панель биохимической дифференцировки стафилококков.

Системы автоматизированной идентификации.

Принцип действия тот же, что и в предыдущем пункте. Но инкубация панелей, учет результатов и идентификация проводятся при помощи компьютера.

Методические указания:

Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред "пестрого ряда".

1.Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей в среды "пестрого ряда".

2.Посевы инкубируют при 37° С в течение 18—24 ч или больше.

3.В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды;

4.При разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке.

5.Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика.

При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют "пестрым рядом».

Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью среды Клиглера

1. Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают петлей на среду Клиглера

2. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 18—24 ч.

3. В том случае, если бактерии ферментируют лактозу до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды с красного на желтый в области скошенной части.

4. В том случае, если бактерии ферментируют глюкозу до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды с красного на желтый в области «столбика».

5. В том случае, если бактерии выделяют сероводород, наблюдается изменение цвета среды с красного на черный в области «столбика».

6. При разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляются пузырьки газа в толще среды.

При отсутствии ферментации цвет среды не меняется.

Контрольные вопросы:

1.Для чего проводится идентификация микроорганизмов?

2. Какие методы идентификации наиболее часто применяются в современных бактериологических лабораториях?

3. Для чего применяется «пестрый ряд» и каков его состав?

4. Что такое протеолитические свойства? Каким образом можно их определить?

5. Что такое СИБы? Для идентификации каких бактерий их применяют?

Список литературы:

Обязательная:

1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.

3. Коротяев А. И., Бабичев С. А., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г

4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.

2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974.

3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982 г.

Занятие № 6 Физиология микроорганизмов. Дыхание микроорганизмов. Анаэробы. Методы культивирования. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Дезинфекция. Стерилизация.

Цель: Изучить принципы создания сред для анаэробов и методы их культивирования, основные методы стерилизации и дезинфекции и оборудование, применяемое для этого.

Знать: Особенности дыхания микроорганизмов, основные методы выделения чистых культур анаэробов, состав питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, способы контроля дезинфекции и стерилизации.

Уметь: Описывать культуральные свойства анаэробных бактерий и уметь выбрать способ дезинфекции и стерилизации в зависимости от свойств объекта.

Обоснование темы: Анаэробы являются возбудителями многих заболеваний, для их диагностики требуются специфические методы культивирования.

Вопросы для самоподготовки:

1.Дыхательные цепи микроорганизмов.

2.Классификация микроорганизмов по типу дыхания.

3.Особенности питательных сред для анаэробов.

4. Создание условий для культивирования анаэробов.

5. Методы выделения чистой культуры анаэробов.

6. Стерилизация и дезинфекция.

7. Контроль качества дезинфекции и стерилизации.

ПЛАН

Программа:

1. Изучение питательных сред для анаэробов: среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, агар Цейсслера, молоко по Тукаеву.

2. Описание культуральных свойств анаэробов.

3. Изучение способов создания анаэробных условий.

4. Методы стерилизации; аппаратура, используемая для стерилизации.

5. Методы дезинфекции.

6. Методы контроля эффективности стерилизации и дезинфекции.

Демонстрация:

1. Питательные среды – среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, агар Цейсслера.

2.Варианты роста анаэробов на этих питательных средах.

3. Эксикатор, анаэростат.

4. Аппаратура, применяемая для стерилизации.

Задание студентам:

1. Зарисовать и записать состав и назначение питательных сред: среда Кита-Тароцци, среда Вильсон-Блер, Тиогликолевая среда, среда Вейнтберга, молоко по Тукаеву, агар Цейсслера.

2. Описать особенности роста анаэробов на питательных средах.

3. Учесть результаты опытов, поставленных с целью контроля стерилизации. Сделать заключение. Заполнить таблицу: Методы контроля режима стерилизации.

4. Определить по готовым посевам антибактериальное действие УФ-излучения на стафилококки.

5. Заполнить таблицу: Основные методы дезинфекции и контроля качества дезинфекции.

6. Оценить результаты посева материала на скошенный МПА.

Информационный материал.

Питательные среды для выращивания анаэробов:

Среда Вильсон-Блер (железосульфитный агар) готовиться из питательного агара, к которому добавляется глюкоза, сульфит натрия, хлорид железа (2). Анаэробные клостридии на этой среде образуют колонии черного цвета за счет восстановления сульфита натрия в сульфид, который, соединяясь с хлоридом железа, дает черный осадок.

Среда Китта-Тароцци. Состоит из питательного бульона, 0,5 % глюкозы и кусочков печени. После посева среду заливают небольшим слоем вазелинового масла.

Тиогликолевый бульон с гемином (элективная среда для культивирования неспорообразующих анаэробов). Состоит из гемина, гидролизата казеина, глюкозы, цистеина, сульфата натрия, хлорида натрия, тиогликолата натрия.

Сахарно-кровяной агар Цейсслера. Состоит из питательного агара, 1-2 % глюкозы, дефибринированной крови.

Среда Вейнберга. Состоит из питательного агара, печени, фосфата натрия, 0,5 % глюкозы, хлористоводородной кислоты.

Стерилизация (обеспложивания, «sterilis»—бесплодный)– полное уничтожение объекта от всех микроорганизмов, находящихся как в вегетативных, так и споровых формах. Для стерилизации применяют в основном физические методы: стерилизация в сушильно-стерилизационном шкафу, стерилизация текучим паром, тиндализация, автоклавирование, прокаливание, воздействие ионизирующих излучений, кипячение. Методы стерилизации

1. Физические методы. Существуют различные способы стерилизации при помощи высокой температуры

1. Прокаливание на огне - фламбирование (спиртовка) — применяется для стерилизации бактериологических петель, препаровальных игл, предметных стекол, пинцетов.

2. Кипячение применяется редко. Кипячением в воде в течение 10-40 минут можно стерилизовать многоразовые шприцы, иглы.

3. Стерилизация сухим жаром производится в печах Пастера. Сегодня для этой цели применяются сухожаровые шка­фы различных марок. Простейшая печь Пастера состоит из металлической емкости с двойными стенками, оборудованной термометром для контроля температуры и нагревательным элементом.

Приготовленный соответствующим образом материал ставят в печь и стерилизуют в течение 45 минут при температуре 165—170°. Пробирки, колбы, флаконы закрывают ватными пробками.

4. Стерилизация паром проводится при более низкой температуре чем стерилизация сухим жаром, и производится при температуре в 100—120°.

Различают:

1) стерилизация паром под давлением,

2) стерилизация текучим паром.

Стерилизация паром под давлением — основана на том, что образующийся пар не выходит наружу, а скапливается в замкнутом пространстве и повышает давление. Соответственно давлению повышается и температура кипения воды; при повышении давления на 1 атм. температура кипения будет равна 120°, при повышении давления на 2 атм.— 134,18° и т. д. При такой температуре микро­организмы и их споры погибают очень быстро (при 120° в течение 15—20 минут).

Этим способом стерилизации пользуются для обеспложивания питательных сред, лабораторной посуды, металлических и стеклянных инструментов, для обеззараживания инфекционного материала.

Стерилизация паром под давлением производится в автоклавах. На сегодняшний день это самый распространенный способ стерилизации в бактериологической практике

Автоклав представляет, собой металлическую цилиндрическую емкость с толстыми двойными стенками и с герметически закрывающейся массивной крышкой. Автоклав оборудован манометром и термометром для контроля давления и температуры. Под дном автоклава находятся нагревательные элементы. Стерилизуемые предметы помещают внутрь емкости и герметично закрывают крышку, начинается повышение давления и температуры.

Стерилизация текучим паром производится в аппарате Коха (рис. 38), представляющем собой высокий металлический цилиндр, с двойным дном и неплотно закрывающейся крышкой, снабженной термометром. На дно аппарата наливают воду, подогреваемую снизу до кипения. Образующийся пар выделяется через края неплотно закрытой крышки. Стерилиза­цию производят в течение 30—40 минут с момента выделения пара.

Стерилизацию текучим паром можно производить также и в автоклаве; в таком случае крышка автоклава остается незавинченной, а выпускной кран открытым. Текучим паром стерилизуют предметы, портящиеся от действия высокой температуры (питательные среды).

Однократная обработка текучим паром не обеспечивает полной стерилизации, так как при температуре в 100° гибнут вегетативные формы, но не споры бактерий. Полное обеспложивание при помощи текучего пара достигается при повторной (дробной) стерилизации.

Дробная стерилизация. Дробной стерилизации подвергаются материалы, не переносящие температуры выше 100° (жела­тина, молоко, питательные среды с углеводами). При температуре в 100°погибают вегетативные фор­мы бактерий, затем дают оставшимся спорам прорасти в вегетативные формы и через сутки снова стерилизуют материал при 100°. Оставшимся спорам снова дают прорасти и через сутки снова стерилизуют материал при 100°, добиваясь таким образом 100% стерилизации

Тиндализация представляет собой дробную стерилизацию при низкой температуре, предложенную Тиндалем для объектов, не переносящих температуры в 100°. Их подвергают нагреванию в течение 5—6 дней подряд при более низкой температуре (56—60°) по 1 часу ежедневно. Тиндализация производится или на водяной бане, или в специальных приборах с терморегуляторами.

Пастеризация. Метод предложен Пастером для частичной стерилизации жидкостей, теряющих свои качества под действием высокой температуры), используется при температурной обработке продуктов питания(соки, молоко, вино). Способ основан на том, что при нагревании жидкости до 50—60° в течение 15—30 минут или до 70—80° в течение 5—10 минут погибает большинство бесспоровых микробов, а споры остаются жизнеспособными. Поэтому необходимым условием является упаковка и охлаждение пастеризованного продукта.

В бактериологической практике пастеризация при 90° применяется для разделения споровых и бесспоровых видов бактерий.

5. Обработка материалов рентгеновскими, ультрафиолетовыми, γ-лучами

Радиационный метод стерилизации используется для стерилизации изделий медицинского назначения одноразового применения (одноразовые чашки Петри)

Стерилизация ультрафиолетовым облучением используется для стерилизации воздуха помещений медицинского назначения, сложных изделий медицинского назначения (искусственный клапан сердца и т.д.)

2. Механические методы стерилизации.

Стерилизация фильтрованием.

Применяется в тех случаях, когда материал не может быть подвергнут нагреванию (сыворотки, белковые лекарственные вещества и т. д.).

Для этой цели применяются фильтры тонкой очистки из мелкопористых веществ. Они готовятся в виде цилиндрических свечей (фильтр Шамберлана, Берке-Фельда) или асбестовых пластинок (фильтр Зeйтца).

Фильтрование производится под повышенным давле­нием, вследствие чего жидкость нагнетается через поры фильтра в приемник, или же создается разрежение в приемнике и тогда жидкость всасывается в него через фильтр. Поэтому к фильтрующему прибору присоединяется или нагнетающий, или разрежающий насос.

Наиболее простым способом является фильтрование с по­мощью водоструйного насоса: в приемнике создается отрица­тельное давление и жидкость всасывается через фильтр. Стерильность профильтрованной жидкости проверяется путем ее посева на питательную среду - посев остается стерильным.

3. Химические методы. Методы основаны на обработке оборудования химическими веществами, обладающими бактерицидными свойствами. Применяются при стерилизации приборов и материалов, чувствительным к высоким температурам.

Дезинфекция – мероприятия, направленные на уничтожение или снижение численности микроорганизмов. Для дезинфекции применяют физические и химические методы.

Механические методы – влажная уборка.

Физические методы: кипячение, сжигание трупов.

Химические методы: методы с использованием веществ, обладающих антисептическими свойствами (дезинфектантов)

Классификация дезинфектантов

1. галогенсодержащие дезинфектанты (имеют в своем составе галогены) — препараты йода (спиртовой раствор йода, раствор Люголя, йодоформ, йодинол, йодопирин), хлора (хлорамины, хлориты);

2. перекисные соединения - перекись водорода, пергидроль (30% водный раствор перекиси водорода) дезоксон-1 и др.

3. кислоты и их соли - борная, салициловая, тетраборат натрия, калия перманганат, щелочи - аммиак и его соли, бура;

4. спирты - 70°—80° этанол и др.;

5. альдегиды - формальдегид, гексаметилен-тетрамин, бетапропиолактон;

6. детергенты - декамин, хлоргексидин, этоний и др.

7. поверхностно-активные вещества, относящиеся к четвертичным аммониевым соединениям и амфолитам (ниртан, амфолан и др.)

8. производные 8-оксихинолина - хинозол, интестопан, нитроксолин, 4-хинолона - оксолиновая кислота, хиноксалина - хиноксилин, диоксидин;

9. производные нитрофурана - фурацилин, фурагин, фуразолидон;

10. производные фенола - трикрезол, фенилрезорцин, фенилсалицилат;

11. дегти - деготь березовый, ихтиол и др.;

12. красители - бриллиантовый зеленый, метиленовый синий, этакридина лактат;

13. соединения тяжелых металлов - дихлорид ртути, нитрат серебра, колларгол, протаргол, сульфат цинка.

14. газовая смесь из оксида этилена с метилбромидом

Методические указания:

1. Схема описания культуральных свойств микроорганизмов:

1.Форма колонии

2.Размер колонии

3.Цвет

4.Характер края

5.Характер поверхности

6. Консистенция

2.Окраска по методу Грама:

1. На фиксированный мазок нанести основной краситель – генциановый фиолетовый через полоску фильтровальной бумаги. Выдержать 2 мин.

2. Не промывая мазок, нанести раствор Люголя на 1 мин.

3. Обесцветить этиловым спиртом 5-10 сек.

4. Промыть водой

5. На мазок нанести дополнительный краситель – водный фуксин. Выдержать 2 мин.

6. Промыть водой.

7. Высушить с помощью полоски фильтровальной бумаги

3. Таблица. Основные методы дезинфекции и контроля качества дезинфекции.

Поиск по сайту: