Информационный материал

Ген – структурная и функциональная единица наследственной информации, участок ДНК, контролирующий синтез определенного белка.

Геном - совокупность генов гаплоидного набора хромосом клетки.

Амплификация - увеличение числа копий генов / часто плазмид молекулярным весом / в клетке.

Элиминация - удаление генов из клетки / особенно плазмид под действием УФ, акридиловых красителей/.

Траспозоны - участки ДНК, способные к перемещению внутри молекулы и от одной к другой, могут быть переданы из клетки в клетку.

Is – последовательности - нуклеотидные последовательности, не кодирующие выработку белка, а ответственные за встраивание транспозонов в молекулу ДНК.

Мутация - изменение генотипа.

Сексдуция - перенос фрагмента хромосомы F – фактора при конъюгации.

Трансдуцирующий фаг - умеренный фаг, который переносит бактериальные гены от донора к реципиенту.

Фактор компетенции - особый белок, создающий условия для трансформации в клетке.

Генетический аппарат бактерий имеет ряд особенностей организации.

Особенности генетического аппарата бактерий:

а/ цитологические:

1. Наследственный аппарат бактерий представлен нуклеоидом;

2. В отличие от ядра нуклеоид не имеет ядерной мембраны;

3. В нуклеоиде нет ядрышек;

4. В нуклеоиде одна хромосома;

5. В бактериальной клетке может быть дополнительное наследственное вещество – плазмида;

6. Молекула ДНК хромосомы и плазмиды прикрепляются к ЦПМ.

б/ молекулярные:

1. Хромосома бактерий имеет кольцевую структуру;

2. Хромосома бактерий – чистая двунитчатая ДНК, не содержит гистонов;

3. В ДНК бактерий повышенное содержание метиллированных / минорных / азотистых оснований, или выполняют защитную функцию гистонов;

4. ДНК бактерий содержит is – последовательности, строение которых аналогично таким же участкам ДНК у высших организмов;

5. Отмечается выраженная изменчивость нуклеотидного состава:

Соотношение гуанина и цитозина /Г/Ц – индекс/ у бактерий имеет видовые отличия.

Важное место в генетике бактерий занимают плазмиды – дополнительные, внехромосомные элементы наследственности / внехромосомная молекула ДНК, гены которой отвечают за ряд селективных свойств и способен к автономной репликации.

Плазмида, как и хромосома, представлена кольцевой двунитчатой ДНК, но ее размеры значительно меньше хромосомы. Плазмида содержит структурные гены, кодирующие тот или иной признак, гены автономной репликации, is – последовательности. У некоторых плазмид есть гены, ответственные за ее трансмиссивность / перенос, передачу/. Такие плазмиды называются трансмиссивными / конъюгативными /.

Основные свойства плазмид:

1. Гены плазмид несут не обязательную для клетки информацию, а лишь сообщают ей селективные преимущества; без плазмид клетка существовать может, а без хромосомы нет;

2. Плазмидная ДНК имеет значительно меньшую молекулярную массу, чем хромосомная;

3. Плазмиды способны к автономной репликации или их репликация находится под ослабленным контролем хромосомы;

4. Для плазмид с низкой молекулярной массой характерно явление амплификации / многопийности /;

5. Некоторые плазмиды /F, R – факторы/ способны находиться как в автономном, так и интегрированном с хромосомой состоянии; штаммы, у которых F- фактор интегрирован с хромосомой, - H¦r – штаммы;

6. Молекула ДНК плазмид более подвержена воздействию физических и химических агентов, чем хромосомы; частота плазмидных мутаций выше, чем хромосомных;

7. Некоторые физические /УФ, СВЧ и др./ и химические / акридиловые красители/ агенты вызывают алиминацию / удаление, потерю / плазмид;

8. Плазмиду могут содержать tra – гены и самостоятельно передаваться в процессе конъюгурации, это конъюгативные плазмиды; частота передачи плазмидных генов выше, чем хромосомных; трансмиссионность /передача, перенос / плазмид может быть связан и с переносом их в клетки умеренными трансдуцирующими фагами;

9. В клетке могут находится несколько разных плазмид, но некоторые плазмиды несовместимы между собой; по этому признаку различают группы несовместимости плазмид.

Плазмиды могут детерминировать разные свойства бактерий. Различают:

1. R – плазмиды – кодируют лекарственную устойчивость;

2. F – плазмиды – определяют пол бактерий;

3. Col – плазмиды – детерминируют синтез бактериоцинов;

4. Hlj - плазмиды – кодируют синтез гемолизинов;

5. Ert – плазмиды – детерминируют синтез энтеротоксина;

6. Плазмиды биодегративные – обуславливают расщепление сложных ароматических и других соединений, например, нефти, парафина, ПАВ и др.

Плазмиды играют важную роль в процессах рекомбинации /обмена генетической информации/ у бактерий.

У бактерий имеется 2 типа изменчивости: фенотипическая и генотипическая.Фенотипическая изменчивость (модификации)- это изменение внешних признаков, не затрагивающее генотип.

Фенотип- совокупность всех признаков и свойств организма, сформировавшихся в процессе его индивидуального развития; фенотип определяется взаимодействием генотипа с условиями окружающей среды.

Генотипическая изменчивость затрагивает не только фенотип но и генотип - совокупность всех генов клетки.

Проявлениями фенотипической изменчивости у бактерий являются модификации: кратковременные / в пределах одного поколения/ и длительные/ сохраняются в поколениях/.

Отличия длительной модификации от мутации

1. Отсутствие изменений в структурных генах генотипа;

2. Приобретение новых свойств большим числом особей в популяции;

3. «Затухание» /исчезновение/ признака в ряду поколений.

Примером фенотипической изменчивости бактерий является диссоциация - расщепление признака при изменении условий культивирования: переход форм с гладкими колониями в Р – формы с шероховатыми колониями, потеря пигмента, появление неподвижных вариантов у подвижных бактерий и т.д.

Генотипическая изменчивость бактерий связана с мутациями и рекомбинациями. /см. словарь основных терминов/.

Мутации у бактерий могут быть спонтанные и индуцированные известным мутагеном. По локализации различают: а / генные – затрагивают один ген; б/ хромосомные – затрагивают группу генов; в/ плазмидные – затрагивают гены плазмид.

Механизм мутаций Вам известен. Это: а/ делеция – потеря гена или участка ДНК; б/ дупликация – удвоение генетического фрагмента; в/ транспозиция – изменение положения гена; г/ инверсия – переворот участка ДНК на 180°; д/ вставка нового гена.

Фенотипическое проявление мутаций чаще ведет к потере признака – прямая мутация или к его восстановлению – обратная мутация. Так как у бактерий одна хромосома, то частота фенотипических проявлений мутаций высока, а делеция большого участка хромосомы летальна для бактерий.

Вторым механизмом генотипической изменчивости у бактерий являются рекомбинации. - перераспределение генетического материала родителей в потомстве / обмен генетического материала, приводящий к появлению новых сочетаний генов/.

Особенности рекомбинации у бактерии:

1. Однонаправленность переноса генетической информации /от донора к рецепиенту/;

2. Неодинаковое долевое участие генома и реципиента в образовании рекомбинанта /реципиентный геном полностью переходит к рекомбинанту, а от донора только отдельные гены, плазмиды/;

3. В результате рекомбинации образуется мерозигота /частичная зигота/;

4. Наличие нескольких механизмов рекомбинаций: конъюгация, трасформация, трансдукция, слияние протопластов.

Механизмы рекомбинации:

I. Конъюгация – перенос генетической информации при непосредственном контакте донора и реципиента. Это аналог полового процесса у бактерий. Поло у бактерий определяет F – плазмиды: в «мужских» клетках /F⁺/ она есть, в «женских» /F^-/ - отсутствует.

Отличия f⁺ b f^- клеток

1. У F⁺ клеток есть дополнительная генетическая информация /F – фактор/;

2. F⁺ клетки имеют на поверхности специальные ¦ - пили, обеспечивающие контакт при конъюгации;

3. F⁺ клетки имеют дополнительный ¦i – антиген / белок ¦ - пилей/;

4. F⁺ и F^- клетки отличаются поверхностным зарядом;

5. F⁺ клетки чувствительны к «мужским» фагам, которые не адсорбируются на F- клетках;

6. F⁺ клетки обладают свойствами донора/отдают генетическую информацию/, а F^- клетки – свойствами реципиента /воспринимают генетическую информацию/. Как уже указывалось, рецепиентные клетки участвуют в образовании рекомбинанта всем своим геномом, а донор передает свою генетическую информацию лишь частично. Чаще это конъюгативные плазмиды, но H¦r – штаммы /см. словарь основных терминов/ передают с высокой частотой хромосомные гены при коньюгации.

II. Трансдукция – перенос генетической информации от донора к рецепиенту с помощью трансдуцирующего фага. Трандуцирующий фаг – это умеренный фаг, при который при индукции дизогенной культуры захватывает соседние бактериальные гены и при инфицировании новых клеток вносит в них эти гены.

При строгой специфичности локуса интеграция умеренного фага с хромосомой лизогенной клетки /например, для фага l - рядов с lас – опероном, для фага Р – рядов с trp – опероном и т.д./ при индукции захватываются и переносятся всегда строго определенные гены – это специфическая трансдукция. Перенос случайных бактериальных генов умеренным фагом – общая трансдукция. Захват случайных бактериальных геновы может происходить при сборке фагов или в том случае, каогда профаг не имеет строго определенного локуса в геноме бактерий.

Изменение свойств бактерий, инфицированных умеренным фагом, может происходить и под действием генов самого фага – явление фаговой, или лизогенной конверсии.

Отличия трансдукции от фаговой конверсии:

1. Приобретение новых свойств при трансдукции идет за счет бактериальных генов, а при фаговой конверсии – за счет фага.

2. Частота трансдукции значительно ниже частоты фаговой конверсии.

III. Трансформация – передача генетической информации при культивировании реципиента на среде с ДНК донора.

Трансформация возможна у близкородственных бактерий. Реципиент получает не всю молекулу ДНК донора, а ее отдельные фрагменты. Реципиенты клетки должны быть в состоянии компетентности. У клетки, готовой воспринять генетическую информацию, обнаруживается особый белок – фактор компетентности. Его действие связывают: а/ с повышением проницаемости клеточной стенки и ЦПМ для ДНК, б/ с ингибированием ДНК-аз, в/ с активированием синтеза и рестриктаз. Это состояние наблюдается в процессе деления клетки. Когда она активно строит свою ДНК, то в этот момент могут быть захвачены фрагменты чужой ДНК. In vivo в популяции часть клеток всегда активно размножается, а часть погибает, то есть имеются условия для трансформации. In vitro эти условия создают искусственно.

Молекулярно-биологические методы идентификации

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Принцип метода:

Исследуемый материал подвергается специальной обработке, при которой происходит лизис клеток с выходом ДНК. Часть материала переносится в пробирку, содержащую смесь мононуклеотидов, ДНК-полимеразу и праймер – уникальную последовательность нуклеотидов, присущую искомому возбудителю. Циклическое изменение температуры (30 циклов) позволяет осуществить репликацию определенного возбудителя. Этот процесс называется амплификацией, в результате которого количество специфической ДНК увеличивается в миллионы раз. Такие количества ДНК могут быть выявлены с помощью электрофореза в агаровом геле. Преимуществами метода ПЦР являются:

1. Универсальность. При помощи ПЦР можно определять ДНК в любых биологических образцах. Причем это в равной степени относится как к ДНК микроорганизмов, так и к ДНК человека.

2. Высокая специфичность. Специфичность определяется тем, что в ПЦР определяется уникальный участок гена, характерный только для данного возбудителя. Для повышения специфичности возможно определятьнесколько разных генов одного микроба. Так, например, для определения Ureaplasma urealyticum можно выявлять как ген 16S-RNA, так и ген уреазы. А для идентификации Chlamydia trachomatis, помимо определения хромосомальной ДНК и ДНК криптической плазмиды сталовозможным выявлять рибосомальную РНК (NASBA). Это значительно повышает достоверность исследования.

3. Высокая чувствительность. Полимеразная цепная реакция способна выявлять единичные копии ДНК. В среднем порог чувствительности большинства современных тест-систем составляет от 10 до 100 копий ДНК. Это значительно превышает чувствительность культуральных методов исследования.

4. Малый объем биологического материала. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в педиатрии, неонатологии, неврологии, судебной медицине.

5. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях.

Недостатки метода ПЦР

1. Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма. Это налагает определенные требования при использовании ПНР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя. Однако, метод выявляет РНК только живых микроорганизмов и позволяет избежать этих ограничений.

2. Высокая чувствительность. Ряд микроорганизмов (условно-патогенная флора, УПФ) в норме может существовать у человека в малом количестве. При помощи метода ПЦР определяются даже самые малые количества УПФ, даже при отсутствии патологии. Однако эта проблема решена с появлением метода количественного определения ДНК (Real-time PCR).

3. Различия при использовании разных тест систем. Как говорилось выше, для амплификации можно использовать различные участки генома возбудителя. Однако в случае различных мутации микроорганизмов возможно изменение или утрата генов. Это приводит к разным результатам при использовании тест систем разных производителей

ДНК зондирование.

Принцип метода: Исследование проводят с помощью нуклеиновых зондов – фрагментов ДНК, комплементарных уникальным участкам микробного генома и несущих метку (радионуклид, фермент или флюорохром). Включение метки обеспечивает высокую чувствительность метода. В зависимости от выбранного генетического фрагмента зонды могут быть родо-, видо- или типоспецифическими.

Сазернблоттгшг (гибридизация по Сазену) - выявление участка ДНК путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом и фиксированных на мембране фрагментов искомой ДНК с мечеными комплементарными ДНК-зондами. Сначала с помощью гель-электрофореза разделяют фрагменты ДНК. После электрофореза гель переносят в щелочной раствор для получения из двунитевой ДНК однонитевых фрагментов. Затем фрагменты ДНК переносят из геля на нитроцеллюлозную или нейлоновую мембраны и гибридизируют со специфической меченой пробой ДНК (комплементарным олигонуклеотидным зондом, меченным радионуклидом или флюо-рохромом). Неспецифически связанные молекулы зонда отмывают­ся, а меченые участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография), на которой проявляются полосы меченого зонда ДНК. Зонды, меченные флюорохромом, вы­являют при помощи люминесцентной микроскопии. Нозернблоттинг применяют для выявления и гибридизации РНК (фрагментов РНК). В этом методе размер и количество специфических молекул и РНК определяются после обработки общей РНК или поли(А)РНК. Молекулы РНК выделяют гель-электрофорезом и переносят на иммобилизованную мембрану. Искомые последовательности РНК определяют гибридизацией с меченой пробой.

ДНК- ДНК -гибридизация

ДНК-ДНК-гибридизация основана на денатурации, т.е. разделении двунитевой ДНК на отдельные нити в щелочной среде при температуре около 90 °С и последующем восстановлении (отжиге) двунитевой структуры с комплементарной меченой нитью ДНК (молекулярным зондом) при понижении температуры до 10-37 °С. Гибридизацию часто проводят на фильтрах (блот-гибридизация), или in situ. Молекулярный зонд с присоединенным биотином гиб-ридизируется на ДНК-мишени. После отжига и промывки на обра­зец наносят антибиотиновый конъюгат (стрептавидин, соединенный с щелочной фосфатазой) и проводят специфическое окрашивание клеток. Стрептавидин можно метить, кроме щелочной фосфатазы, флюорохромами. Стрептавидин с меткой избирательно связывается биотином, что выявляется при микроскопии. Так выявляют локали­зацию микробов в ткани, хромосомные аномалии в клетках и т.д.

Риботипирование

Риботипирование - выявление количественных различий по рибосомным оперонам и нуклеотидным последовательностям. Про­водят гидролиз ДНК, которую разделяют в агарознок; геле и затем гибридизируют с ДНК-зондами на один или более генов, кодирую­щих 16S-, 23S-, 58-рибосомные РНК. Бактерии можно типировать по серотипу, фаготипу и по риботипу. Методически сходно с рибо-типированием IS-типирование: проводят сравнительный анализ числа копий IS-элементов и рестрикционного разнообразия нуклеотидных последовательностей различных штаммов микробов.

Рестрикционный анализ

ДНК расщепляют с помощью рестриктаз (бактериальных эндонуклеаз), которые распознают и разрывают определенные последовательности нуклеотидов в нужных участках. Отдельные рестриктазы способствуют вьщелению строго определенных фрагментов ДНК. Размер полученных фрагментов ДНК можно определить путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. После электрофореза каждый фрагмент ДНК располагается в определен­ном участке геля в виде дискретной полосы. Фрагменты ДНК выявляют путем обработки геля бромидом этидия, который связывается с ДНК. Такие фрагменты ДНК высвечиваются при ультрафиолетовом облучении в красной области спектра. Длину каждого фрагмен­та можно выявить, сравнивая расстояние, пройденное фрагментом ДНК при электрофорезе, с расстоянием, пройденным стандартным фрагментом ДНК известного размера.

Методические указания:

Таблица: Классификация и функции плазмид.

Таблица: Молекулярно-генетические методы лабораторной диагностики.

Контрольные вопросы:

1.Чем отличается строение генома бактерий от клеток эукариотов?

2. Что такое рекомбинации и каковы их основные виды?

3. Каково значение плазмид?

4. Какие достоинства и недостатки имеются у метода ПЦР?

5. Назовите основные методы внутривидового типирования микроорганизмов.

Список литературы:

Обязательная:

1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.

3. Коротяев А.И., Бабичев С.А., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г

4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.

2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974.

3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982

Занятие № 10. Контрольное занятие по теме «Морфология и физиология микроорганизмов».

Цель: проверить знания по теме «Общая микробиология».

Знать: классификацию, морфологию, физиологию и генетику микроорганизмов.

Вопросы для самоподготовки:

1. История микробиологии. Этапы развития. Современные задачи. Вклад российских ученых в развитие микробиологии и иммунологии.

2. Предмет и задачи медицинской микробиологии и иммунологии. Клиническая микробиология, ее задачи. Критерии этиологической диагностики. Диагностика нозокомиальных инфекций.

3. Бактериологическая лаборатория. Классификация и значение. Оборудование рабочего места. Правила поведения в бактериологической лаборатории.

4. Основные систематические группы микроорганизмов. Понятия «популяция», «культура», «штамм», «колония», «клон». Бактерии: определение, систематическое положение. Тесты для дифференциации представителей различных семейств бактерий.

5. Морфологические формы бактерий. Понятие о морфологических свойствах микроорганизмов. Нитчатые формы бактерий: актиномицеты, нокардии.

6. Структура и химический состав бактериальной клетки. Клеточная стенка, микроорганизмы с дефектной клеточной стенкой, их характеристика, строение, репродукция, методы изучения, роль в патологии человека, лабораторная диагностика.

7. Строение и функции цитоплазматической мембраны, цитоплазмы, рибосом, мезосом бактериальной клетки. Ядерный аппарат бактерий и его особенности.

8. Споры, капсулы, жгутики, реснички, ворсинки, фимбрии, пили. Функциональное назначение органелл. Методы выявления. Определение подвижности бактерий.

9. Тинкториальные свойства бактерий. Цели и методы окраски.

10. Иммерсионный микроскоп. Особенности устройства. Принцип действия. Использование в практике.

11. Методы микроскопического исследования (люминесцентная, темнопольная, фазово-контрастная, электронная микроскопия). Бактериоскопический метод диагностики, его задачи и возможности

12. Ферменты бактерий. Понятие о биохимических свойствах микроорганизмов. Автоматическая регуляция синтеза ферментов. Идентификация бактерий по ферментативной активности.

13. Типы окислительно-восстановительных процессов у бактерий.

14. Понятие о метаболизме. Анаболизм и катаболизм. Особенности метаболизма у бактерий. Методы изучения метаболизма бактерий. Способы получения энергии бактериями, Мембранное и субстратное фосфорилирование.

15. Особенности дыхательного аппарата бактерий.

16. Структурные особенности наследственного вещества бактерий. Плазмиды бактерий: определение, основные свойства, классификация.

17. Строение генома бактерий. Понятие о генотипе и фенотипе. Виды наследуемой изменчивости. Механизмы передачи генетического материала у бактерий.

18. Механизмы изменчивости. Мутации, их особенности, типы мутантов у бактерий.

19. Модификации у бактерий: кратковременные и длительные. Механизм модификаций. Отличие мутационной изменчивости от длительных модификаций.

20. Типы и механизмы питания бактерий. Классификация бактерий по источникам углерода и азота.

21. Питательные среды, их классификация. Требования, предъявляемые к питательным средам. Рост и размножение бактерий. Фазы роста на жидких питательных средах.

22. Принципы и методы выделения чистых культур микроорганизмов. Культивирование бактерий.

23. Действие физических и химических факторов на микроорганизмы, Использование в практике. Стерилизация, способы, аппаратура. Дезинфекция. Дезинфектанты.

24. Влияние биологических факторов на микроорганизмы. Использование в практике.

25. Понятие о химиотерапии и химиотерапевтических препаратах. Классификация химиопрепаратов.

26. Антибиотики: классификация по источнику получения, механизму и спектру действия.

27. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам. Механизмы формирования и пути преодоления лекарственной устойчивости возбудителей инфекционных болезней. Принципы рациональной антибиотикотерапни. Осложнения антибиотикотерапии.

28. Химиотерапия вирусных инфекций.

29. Бактериофаги. Получение, титрование, использование. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. Умеренные и вирулентные бактериофаги. Применение в медицине Внутривидовое типирование бактерий. Методы. Использование в практике.

30. Основы медицинской биотехнологии.

31. Бактериологический метод диагностики, его задачи и возможности.

32. Вирусы как своеобразная форма жизни. Принципы классификации вирусов. Структура и химический состав вирусов. Особенности биологии вирусов. Репликация вирусных нуклеиновых кислот.

33. Процессы взаимодействия вирусов с чувствительными клетками и факторы, способные их нарушить. Методы культивирования вирусов.

34. Патогенные грибы. Их классификация, особенности биологии.

Список литературы:

Обязательная:

1. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., медицина. 1994 г.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А. М. Микробиология. М., Медицина. 1998 г.

3. Коротяев А.И., Бабичев С.А., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. СпецЛит, 2000 г

4. Борисов Л. Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1973 г.

Дополнительная:

1. Пяткин К.Н., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М., 1980 г.

2. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М., 1974.

3. Шлегель Г. Общая микробиология. М., Мир, 1982

Поиск по сайту: