Лекция 5. На прошлой лекции мы начали изучать РНК

На прошлой лекции мы начали изучать РНК. Оказалось, что это огромная еще не изученная область молекулярной биологии. Сейчас её изучают и классифицируют в группы с общими характеристиками. Мы рассмотрели короткие РНК, в которые входят mi-RNA, pi-RNA, rasi-RNA. А также обсудили общие характеристики длинных некодирующих РНК (linc-RNA).

В данной лекции мы будем рассматривать конкретные примеры реализации функций.

Поговорим про процессированые псевдогены. Фактически, псевдоген – это тот вариант гена, который может быть локализован в любой хромосоме, относительно его исходной копии и быть неактивным на уровне белка. Как мы знаем, какая-то часть псевдогена трансрипционно активна, т.е. она экспрессируется. РНК есть, но белок с нее не образуется за счёт того, что они накопили мутации. Таких псевдогенов у организмов много. Выяснилось, каков их возможный механизм действия. Раньше считалось, что они функционально не имеют никакой нагрузки в клетке. На сегодняшний день вышло очень много интересных статей, где показано, что функции у них есть. Разберем это на основе первой статьи. Есть известный ген PTEN, ген-супрессор опухолевого роста. Выглядит он примерно следующим образом: у него есть открытая рамка считывания, т.е. происходит кодирование белка, есть длинный конец 3’области, который представляет не транслируемую область данного гена. В этой области находятся сайты связывания с микро РНК, с малыми некодирующими РНК. Соответственно на другой хромосоме, в другом месте находятся псевдогены этого гена, которые также имеют открытую рамку считывания, но она имеет какое-то количество замен, поэтому белка с этого псевдогена еще не было зарегистрировано. Но она имеет 3’ нетранслируемую область, она очень похожа на область, которую имеет сам ген. За счет гомологии, мы имеем одинаковые сайты посадки тех же самых микро-РНК, что и у самого гена. То есть, если в клетке есть 2 похожих РНК, имеющих одинаковые сайты посадки микро-РНК, то можно производить регуляцию экспрессии гена. Если мы увеличим концентрацию РНК, полученных с псевдогена, то они будут отвлекать микро-РНК на себя, увеличивая экспрессию обычного гена.

Оттягивание на себя микро-РНК, присущее псевдогенам, было обнаружено у некоторых lncRNA. Любая ли РНК может оттягивать на себя микро-РНК или только lncRNA? Оказывается, любая, так как в РНК мире всё определяется первичной последовательностью, поэтому микро-РНК могут оттягиваться на любую гомологичную РНК.

Другой интересный класс некодирующих РНК - кольцевые РНК. Они открыты относительно недавно, но при внимательном изучении литературы оказалось, что на самом деле они были открыты очень давно. Первая статья вышла в 1993 году. Как правило есть тенденция, в хорошей статье очень много авторов, поэтому сейчас найти статью, которая была бы выполнена одним автором, фактически невозможно. Статья Кевин Джарела является тем самым редким исключением. Для одного гена Джарел обнаружил, что при определённом сплайсинге может вырезаться фрагмент, после чего оставшаяся РНК кольцуется. Спустя какое-то время, в другом гене было обнаружено, что он может образовывать 2 кольцевых РНК размером 648-900 нуклеотидов. И хотя кольцевая РНК была открыта давно, но что с ней делать было не известно. В 2011 году вышла статья, в которой ученые исследовали 1 локус, в котором находился ген CDR1. На одной цепи этого гена была обнаружена РНК, которая может кольцеваться. А через 2 года вышли 2 работы, опубликованные в журнале NATURE, схожие по тому, как они были сделаны, одна - немецкими учеными, другая- коллективом ученых из Дании, в которых было показано, что такой процесс сплайсинга и сплайсинга инвертирования, в результате которого могут образовываться кольцевые РНК, происходит очень часто. У человека было найдено около 2000 кольцевых РНК. Если смотреть, как они экспрессируются у человека, то можно увидеть, что они присутствуют в различных клетках. Эти колечки могут сплайсироваться из кодирующих областей, из интронов. Почему же кольцевые РНК так долго не замечали, хотя их и очень много? Дело в том, что у обычной РНК на одном конце находится поли-А хвост. Методы нахождения РНК были направлены на присоединение затравки для обратной ревертазы. А эта затравка как раз и присоединяется на место поли-А хвоста. Поэтому обратная ревертаза не садилась на кольцевые РНК, и учёные их не замечали.. Сейчас, когда осознали, что нужно по-другому ставить реакцию обратной транскрипции (с помощью других праймеров), придумали новые алгоритмы, в результате стали видеть и их. В некоторых случаях кольцевые РНК несут очень важную функцию. В одной немецкой работе было выяснено, какую важную функцию несёт одна из кольцевых РНК. На ней было 77 сайтов для связывания с микро-РНК 7. Становится понятно, что эта кольцевая РНК она может привлекать на себя большое количество микро-РНК, то есть она может являться сильным регулятором микро-РНК. Такие РНК были названы спонжевые (от английского sponge – губка). Имеет ли кольцевая РНК другие функции? Кодирует ли белок? Чисто теоретически это не запрещено, однако таких случаев ещё не было зафиксировано.

Другая РНК Malat1-RNA (более 8000 нуклеотидов), связана с раком. В 2008 году сказали, что она претерпевает уникальный процессинг, она транскрибируется в длинную молекулу РНК, причем в этом месте образуется вторичная структура, которая распознается отдельными РНКазами, расщепляющими РНК, в результате получается часть размером 6 и 7 килобас и 2 отдельных фрагмента, имеющие отдельную судьбу в клетке. Самое интересное, что эта вещь не деградирует, как это можно ожидать за счет того, что в одной части есть повтор из большого количества А, который РНКзы распознают как поли-А хвост. В результате он ими не распознается, а какое-то время существует. Оказалось, что эта часть так же имеет регуляторную функцию, но ассоциированную с другими белками, которые также влияют на сплайсинг. Пока есть эта РНК, сплайсинг регулируется, как только мы ее выключаем, количество белков, которые не регулируются этой РНК, становится больше, и они мешают прохождению сплайсинга.

Другая некодирующаяРНК NEAT1 транскрибируется в виде длинной последовательности порядка 23килобас, представлена в большинстве клеточных тканей. В клетке есть маленькие гранулы, называемые парагранулами, присутствующие в ядре. В разных клетках гранул разное количество. Что с ними делать, не понятно. Известно, что в клетках есть семейство белков, участвующих в образовании этих гранул. Оказалось, что NEAT1 РНК, когда транскрибируется с хромосомы, имеет большое количество сайтов связывания с этими белками, в результате связывания собирается пара-спекула, пара-гранула. За счет привлечения огромного количества белка впитывает в себя и некоторые транскрипты, и считается, что либо они сидят там и ждут своего часа, чтобы транспортироваться в цитоплазму, либо же могут проводить какое-либо изменение РНК.

Другой хороший пример некодирующей РНК RMST. Оказалось, что она взаимодействует с транскрипционным фактором, и когда она взаимодействует, влияет на то, какой сайт связывания узнает транскрипционный фактор. При связи с транскрипционным фактором узнаётся один сайт, а без связи – другой. То есть она влияет на специфичность работы транскрипционного фактора.

Оцифровка далее – Царёв Андрей Викторович

RMST-RNA – длинная некодирующая РНК, она ассоциирована с саркомой(рак).

Некодирущих РНК много – порядка 14000 разных транскриптов, поэтому в превую очередь смотрят, какие же транскрипты РНК связаны с какими-то заболеваниями – либо они могут являться маркерами, либо могут иметь какую-то функцию в патогенезе данного заболевания.

В данном случае такая РНК специфично экспрессируется в мозге, регулирует транскрипцию, она может связываться с транскрипционным фактором SOX2 (очень сильный нейрональный регулятор), когда она с ним связывается, этот SOX2 узнаёт одни мишени, у него сайт связывания только один. Может связываться с 5668 промотерами. Если мы выключаем РНК, то он связывается с совсем другими промоторами, узнавая другой сайт связывания, в результате количество связываний падает в два раза. Т.е. она определяет специфичность связывания данного белка с его мишенями. Подобным образом (как РНК может влиять на работу белка) была выявлена в прошлом году некодирующая Y-РНК. Найдена Y-РНК в бактериях, есть определённая РНКаза, когда Y-РНК связывается с этой РНКазой, образуется комплекс (РНПАЗА, РНПИРНКАЗА). В результате было показано, что с этой РНК она большей частью узнаёт в основном линейные РНК, которые не имеют вторичной структуры. Её субстратами являются РНК, имеющие вторичную структуру, она их активнее «кушает» и таким образом влияет на субстратную специфичность данного фермента.

Это регуляторные РНК регулируют разные процессы. Каждый год функции узнают примерно у 10 новых РНК.

Раз РНК может участвовать в таком большом количестве процессов, то это не должно быть некой привилегией таких функций по отношению только к некодирующим РНК, понятно что и мРНК, которые в первую очередь имеют длинную рибонуклеотидную последовательность, могут участвовать в таких же процессах, альтернативно с них может получаться белок. Т.е. надо воспринимать мир РНК ещё шире.

Если у нас происходит мутация в белок-кодирующих генах, то последствия очевидны. Мутация возникла, образуется какой-то мутантный белок, белок теряет свою функцию, возникает какое-то заболевание. Многие заболевания (патогенез данных механизмов) хорошо изучены, известны различные мутации, где они возникают, можно предсказать их влияние на функцию, потому что у белков уже у большей части определена третичная структура, найдены активные центры. Эта тема более-менее науке хорошо известна.

Мутации в некодирующих РНК – неизученная область молекулярной биологии, и не исследуется пока никем. Это новый мир, который проявился недавно, этот мир только предстоит изучать.

РНК любят образовывать вторичные структуры (шпильки и т.д.) – это определяет ещё дополнительные функции: структурную, регуляторную, ферментативную.

Ферментативная – представителем является РИБОЗИМЫ (т.е. РНК ферменты).

Было давно показано, что некоторые транскрипты могут образовывать вторичную структуру, она может иметь ферментативные свойства, катализировать разные реакции.

Было найдено и охарактеризовано много рибозимов, но пока это осталось в виде фундаментального исследования.

Потенциал образования вторичной структуры колоссален. В работе, сделанной на дрожжах, где было определено до 3000 разных транскриптов, было показано, что порядка 50% транскриптов могут образовывать вторичную структуру. Это было определено с помощью хитрого использования двух разных РНКаз – одна резала только двуцепочечные участки, а другая – одноцепочечные участки. Когда все эти огрызки в итоге просеквенировали, для каждой РНК была составлена карта, где эти вторичные структуры находятся и как они существуют. Другой пример такого же подхода (новый метод) – есть обыкновенный диметилсульфат, который может модифицировать РНК, но только неспаренные аденины и цитозины. Если мы имеем какие-то РНК, обрабатываем их диметилсульфатом, модификация происходит там, где нет этих вторичных структур.

Ученые охарактеризовали транскриптом человека в двух клеточных линиях, показали что in vivo (в клетках), когда белки могут помогать образовывать вторичные структуры, у нас есть одно распределение этих сигналов, если мы денатурируем (полностью убираем вторичные структуры), мы видим какое-то ровное распределение, модифицируются все «буквы», если мы в пробирке даём обратно схлопнуться этим структурам, то мы получаем совсем другую картину. В результате такого сравнения, что существует у нас в клетке или просто существует в пробирке, можно реально изучать, какие структуры где находятся, какие обусловлены белковыми взаимодействиями, а какие просто образуются.

Есть такая гипотеза мира РНК, которая гласит, что вообще РНК была первой макромолекулой, с которой началась первая биологическая жизнь. Она охарактеризовано в виде вот такого ПОВЕРПЛАЙНА(?). Когда-то давно 4,5 миллиарда лет назад образовалась Земля, потом был некий первичный бульон, из него образовались первые проРНК, сложные молекулы, которые организовали какие-то ещё более сложные структуры, из которых появились первые «про клетки», далее, уже после функционирования этих организмов, образовались первые ДНК и белки, дальше пошло по усложнению. Эту теорию поддерживает сам факт существования классической молекулярной догмы, что этот шаг важен, РНК может и самореплицироваться, осуществляет различные функции. Множество других интересных фактов, наблюдаемых учеными в разных системах, начиная с вирусов (как первые самые простые и эффективные живые организмы, которые могут существовать и спокойно выполнять все функции, реплецироваться), и другие наблюдения подтверждают эту теорию.

БЕЛКИ

Мы изучили ДНК, РНК, теперь переходим к белкам (более изученный объект).

Состав

В 1836 году Г.Мульдер высказал предположение, что белки содержат один и тот же радикал (назвал протеином), соответственно охарактеризовал, пошло развитие всей темы, эти исследования пришли к тому, что была сформирована пептидная теория строения белка Эмилем Фишером в 1902 году. На сегодняшний день основным компонентом белков являются аминокислоты. Амино-группу на одном конце, карбоксильную на другом, радикал, который у всех аминокислот различный(рис)

Создано много аналогов природных аминокислот – unnatural aminoacids. У них есть очень важное применение. Рассмотрим один из древнейших вариантов создания вакцины против разных вирусных и инфекционных заболеваний. Выделяем этот вирус или инфекцию, ослабляем (активно облучаем, разрезаем РНК на большое количество мелких кусков, так, что вирус дальше не может размножаться). Далее вводим в организм – он циркулирует по крови, узнаёт какие-то клетки, впрыскивать туда генетический материал (а его толком нет – он весь покромсан в труху) и размножаться не может. Но есть биологический смысл. Т.к. вирус вводим, организм его распознаёт и успевает на него потихонечку вырабатывать эффективный иммунный ответ, который будет обеспечивать устойчивость к данному заболеванию.

Рассмотрим вирус иммунодефицита. Данный вирус высокомутабелен. Разные подходы создания вакцин пока неуспешны. Но есть интересный подход: если мы создаём генетически искусственный вирус СПИДа, берём какой-то важный ген, вносим в него заранее мутацию, то в результате, вирус собирается, но самореплицироваться он не может. Такую вакцину проверили на обезьянах, она хорошо вызывает иммунный ответ. Но из-за быстрой мутации вируса есть 5-10%, которые не обеспечивают полной защиты от вируса.

Другой подход придуман на основе unnatural aminoacids.

Разберём схемку:

Если у нас есть последовательность одного гена, есть старт- и стоп-кодоны, с неё получается какой-то белок. Искусственно можем внести ранний стоп-кодон, получается короткая аминокислотная последовательность – не функциональный белок. Можно сделать специальную тРНК, которая будет узнавать специально этот стоп-кодон, если к ней привесим одну из этих unnatural aminoacids, то она будет встраивать в этот белок эту искусственную аминокислоту. Когда она встроится, белок перестаёт быть функциональным.

Эта схема была реализована сначала на простых клетках человека, был взят флуоресцентный белок GFP, который светится в клетках, в него внесён ранний стоп-кодон, несколько неприродных аминокислот, была специальная тРНК, был специально сконструирован фермент, который пришивает эту аминокислоту к тРНК – аминоацил тРНК синтетаза. Оказалось, что природный аппарат клеточный узнаёт тРНК, может встроить эту аминокислоту. Таким образом мы получаем некий какой-то нефункционирующий объект.

Далее, эту технологию реализовали при получении вакцины от вируса P17 – его промутировали, вставили ранний стоп-кодон, сделали отдельную конструкцию с тРНК и аминоацил тРНК синтетазой, показали, как она может встраивать в клетках эту аминокислоту.

Такая ослабленная вакцина, созданая путем уменьшения вирулентности патогена, но все еще оставляет его жизнеспособным - это некий вариант вакцины будущего. Имея такой вирус, можем этим вирусом себя заразить, он проникнет в наши клетки, встроится где-то у нас в геноме с этой мутацией, но он не будет активен, потому что всё время будет получаться нерабочий белок, он не сможет собираться. Как только нам нужно выработать иммунный ответ к этому вирусу, чтобы появились антитела и мы стали устойчивыми к вирусам СПИДа, пришедшим извне в результате случайных связей, мы можем дополнительно выпить «коктейль»(в данном случае это тоже отдельный вирус, содержащий тРНК и аминоацил тРНК синтетазу), аминокислоты начнут встраиваться. В результате будет получаться нерабочий белок, но он будет позволять вирусу собираться, вирус будет собираться и выходить, иммунный ответ будет вырабатываться. Вирус, может быть, будет дальше встраиваться, но размножаться не сможет, потому что мы регулируем его количеством выпитой аминокислоты. Мы пьем – вирус получается – иммунный ответ создаётся. Прекратили пить – иммунный ответ остался, а вирус размножиться дальше не может.

Классификация аминокислот.

Аминокислоты делятся на неполярные, полярные, с положительными или отрицательными зарядами, ароматические

Их можно классифицировать и по-другому, например, по кислотно-основным свойствам.

Существует большая спекуляция в мире, что есть незаменимые аминокислоты, которые надо отдельно покупать в больших банках, чтобы быть сильными и здоровыми. Но это чушь

Аминокислоты могут обладать сразу несколькими определёнными свойствами из-за своих радикалов

Самым важным стереохимическим свойством аминокислот является то, что в клетках, несмотря на то, что аминокислоты могут занимать две различных конформации (левую и правую), существует только L-форма, R-форма же является токсичной. Существует процесс рацемизации, когда одна из форм переходит в другую, этому помогают определённые белки, исключение из всего – метионин, он присутствует в организме в R-форме.

Амфотерное свойство соединений – обладать как основными свойствами, так и кислотными, т.е. реагировать либо со щёлочью, либо с кислотой. Из-за этих двух боковых радикалов аминокислоты и обладают такими свойствами, поэтому аминокислоты могут перебрасывать протон и активно менять pH, переходя из анионной формы в катионную, или находясь в цвиттер-ионной форме.

Но самое важное свойство – это свойство, которое приводит к образованию пептидных связей. Они образуется из-за реакции дегидратации гидроксильной группы одной аминокислоты с протоном аминогруппы другой аминокислоты, в результате образуется пептидная связь, она характеризуется очень высокой устойчивостью. Поэтому все белочки, которые получаются, они довольно прочные.

Теперь поговорим про структуру белков.

Уровни организации структуры белков: всего их 4. Первичный, вторичный, третичный, четвертичный.

На самом деле, не все белки могут образовывать какую-то структуру, которая определяет функцию белка, оказалось, что все белки утрированно можно поделить на две группы: глобулярные структуры и неглобулярные. Глобулярные – 60%, неглобулярные 40%. Наука пока остановилась на глобулярных структурах, которые можно определить, про неглобулярные структуры работ крайне мало.

Первым человеком, который установил первичную структуру белка, был Фредерик Сенгер (получил Нобелевскую премию в 1958 году за определение первичной структуры белка), сделал он это на молекуле инсулина. Инсулин – очень важный белок, состоит из двух основных полипептидных цепей, связанных друг с другом дисульфидными мостиками. Сенгер придумал метод мягкого щелочного гидролиза полипептидной связи, потом придумал метод разрушения этих дисульфидных мостиков. Разбивая эти полипептиды на фрагменты, он дальше с помощью методов хромотографии определил, какие аминокислоты следуют друг за другом, так и расшифровал первичную структуру.

На сегодняшний день определение первичной структуры очень упростилось, была разработана в первую очередь химия, цикл Эдмуна, который позволяет проводить N-терминальное секвенирование пептидов. У нас есть пептид, далее добавляются определённые реактивы, которые модифицируют N-конец, после этого данная аминокислота модифицирована, она отщепляется, анализируется с помощью хромотографии – таким образом это цикл повторяется для следующих аминокислот. Этот метод позволяет определить до 15 аминокислот – вроде и достаточно, но не то, чего нам хотелось бы.

Выделяем из клетки белок, режем его на много разных пептидов, все эти пептиды разделяют, далее секвенируют каждый пептид отдельно – далее складывают это всё в одну кучу. Данный метод был автоматизирован, были созданы пептидные секвенаторы.

Метод масс-спектрометрии – режем белок на пептиды, каждый пептид обладает своими уникальными массой и зарядом, мы можем определить его уникальную характеристику, сравнить с характеристикой предсказанной, на основании последовательности мы можем посчитать характеристики искусственно и посмотреть. Этот метод активно используется, но он предсказательный и обладает какой-то ошибкой.

Поиск по сайту: