Взятие пат.мат

Пат.мат от больн.живот: 1)смывы со слиз. обол.: нос. и рот.п-тей, конъюктивы глаза, влагалища, препуция и прям.кишки. 2)пораж.на коже и слизистой(стенки афт, папул, корочки, везикулярная и афтозная жидк); 3)фекалия, моча 4)кровь (на вирусовыдел. И д.парных сыв). Доб.. по 1000ед на 1мл стрептомицина и пенецелина. От трупа: 1)кусочки изм.орг и тк; 2)кусочки орг и тк согласно клин. проявл болезни; 3)паренхим.орг(селезенка, почки, печень)+лимф.узлы. Во флакончик. Отрезок кишечника, завяз. Лигатурами На лейкопластыре на пузырьке прост. карандашом-назв.пат.мат, вид живот, кличка, дата взятия. Флакончик в целофан. мешок →в термос со льдом (2/3ч)+1/3 повар.соли (-17С). на термосе –бирка: назв. Хоз-ва, кол-во флаконов, фамилия ветврача, дата взятия. Сопроводит.письмо: назв.хоз-ва, его адрес, все что видел: клин. картина, пат.изм, эпизоотолог дан, предварит.диагноз, назв.лаб, адрес лаб, дата взятия. Треб.к пат.мат: 1)содерж.max кол-во вируса; 2)пат.мат. не д.б. кондеменирован; 3)пат.мат. сохр. актив. вир. во время транспортировки. Пригот.пат.мат: растирают пат.мат. в ступке + физ.р-р. Отсас. вируссод.жидк в пробирку. +по 1000ед пенецилина и стрептомиц.на 1мл. Центрифугир при 1,5-2тыс об/мин 15-20мин Надосад.жидк. отсасыв. Ост.на контакт с антибиот.на 1 ч. Делают высевы на стерильн.МПА, МПБ, среда Киттароццы, Среды Сабуро. Ост.на неск. Дней. Далее исслед.матер. Если есть проросты, то добав.еще антибиотики в том же кол-ве, снова высевы

26.Микроскопический метод исследования:При многих заболев. В цитоплазме и ядре клеток форм.тельца-включения.Размер и форма зависит от вида вируса и стадии развития болезни.Обнаружение телец включений с помощью свет.микроскопа служит основанием для постановки диагноза.Итак:готовят мазки или мазки-отпечатки,иногда используют инфицированные вир.клетки культур тканей.Более удобны мазки-отпечатки(на них более видны включения).Мазки фиксируют на пламени или в этиловом спирте.Фиксирован.мазки и отпечатки окрашивают по соответствующим методикам и просматривают под микроскопом.Окраска по Муромцеву:Мазкификс.вметил.спирте,пром.дистилирован.водой и на 5 мин.погружают в р-р синьки Мансона,разв.водой 1:40,сливают,не промывая водой погружают в10%водный р-р таннина на 8мин. До появл.голубоватойокраски,промывают,высушивают,проводят через равную смесь из равных частей спирта с ацетоном и снова высуш.Заливают в канадский бальзам,Ядраокрашив. Нервных клет в синий цвет(при бешенстве),цитоплазма бледно-голубая.а тельца бледно-фиолетовый с розоватым оттенком с темными включ.Окраска по Михину:фиксир.химическим способом мазки окрашив. 30мин.краской Роман.Гимза(разв.1:10),промывают подкисленным спирторм(1капля ледяной уксусной к-ты на 30мл.96спирта),пром.водой,просушивают и смотрят.Фон должен быть красным,нервн.клеткисиневатые,ядрочерное,а тельца Бабеша-Негри розовато-красные с точечными включ.темно-синего цвета.

Люминисцентная микроскопия. Сущность, методы обработки препаратов.Люминесцентная микроскопия(микроскопическое изучение люминесцирующих объектов в ультрафиолетовом свете с помощью специального люминесцентного микроскопа, снабженного источником ультрафиолетовой радиации и соответствующими светофильтрами) – метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав.При взаимодействии света с веществом может происходить преломление световых лучей и их рассеяние, либо поглощение фотонов молекулами, или то и другое вместе. Если произошло поглощение кванта света, то через 10-9с может происходить испускание части поглощённой энергии в виде кванта света с большей длиной волны: такое излучение называется люминесценцией. Различают собственную (первичную) люминесценцию, наблюдаемую без окрашивания, и вторичную (наведённую), которая возникает после обработки химическим агентом или красителем.Цвет люминесценции, т.е. длина волны излучаемого света зависит от химической структуры и от физико–химического состояния микроскопируемого объекта, что и обуславливает возможность использование люминесцентной микроскопии в целях микробиологической и цитологической диагностики, для дифференцирования отдельных компонентов клеток.У подавляющего большинства биологических объектов их собственная неяркая люминесценция не позволяет проводить люминесцентно-микроскопические исследования и для избирательного выявления определённых структур применяют люминесцентные красители - флуорохромы. Известно несколько десятков органических соединений, с успехом используемых в качестве флуорохромов. К ним относятся красители: тиазоловые, хинолиновые, азокрасители и особенно акриловые производные. Хорошими флуорохромами являются некоторые естественные пигменты (хлорофилл, липохромы), алкалоиды (берберин, хинин), углеводороды (бензпирен, дибензаантрацен). Флуорохромы применяются в сильно разведённых водных или спиртовых растворах (от 1:1000 до 1:100000). Флуорохромирование проводят либо прижизненно, либо на фиксированных препаратах. Методы: флюорохромирования и флюорисцирующих АТ (прямой, непрямой)

Метод Флюорохромирования.МФ основан на окрашивании мазков спец флюорохромными красителями (ФИТЦ). После окрашивания мазок помещают под люм микроскоп, где благодаря ртутно-кварцевым лампам на мазок направляется пучок УФ-лучей, и исследователь в объектив видит светящиеся тельца включения в ядре либо в цитоплазме клетки.

29. Метод флюоресцирующих АТ.МФА основан на специфич свечении образовавшегося комплекса (АГ+АТ) и по существу является аналогом серологической реакции (есть прямой и непрямой, см. 30 и 31)

30. Прямой метод флюоресцирующих АТ.Для работы используют мазки, мазки-отпечатки, гистосрезы. Предполагают, что имеется возбудитель, который является АГ, поэтому на мазок наносят предположит специфич сыворотку (данному возбудителя), меченую флюорохромным красителем (ФИТЦ), препарат помещают в чашку Петри, туда кладут кусок ваты, смоч водой (влажная камера), чашку пом в термостат при темп 37 на 30 мин, препарат вынимают, промывают водой, высушивают и смотрят под иммерс увелич люмин микроскопа. В + случае (АГ и АТ специфичны) обр светящийся комплекс, в – случае – тёмное поле, тк флю АТ смываются при проиывании. Недостаток: необходимо иметь в наличии специфич флюорохр сыворотки на кажд возбудителя болезни (дорогие, малый срок хранения).

31. Непрямой метод флюоресцирующих АТ.1. С использованием антивидовых сывороток.На мазок, мазок-отпечаток, гистосрез нанос предположит специфич сыворотку, пом во влажную камеру при т 37 на 30 мин, препарат промывают, наносят ав сыворотку, меченую ФИТЦ, контакт во влажн камере 30 мин при т 37, препарат промывают, смотрят под иммерс увелич люм микроскопа (+ - свечение, - - тёмный фон).(ав сыворотку получают на биокомбинатах путём гипериммунизации кроликов сывороткой крови того вида животного, на котором была наработанапредположит специфич сыворотка, теАТ в спец сыв-ке становятся АГ для ав сыв_ки, обр комплекс АГ+АТ+АВС+ФИТЦ).2.С использованием антикомплиментарных сывороток.Аналог реакции связ копмлемента (2 сист, 5 компонентов). На мазок, отпечаток, гистосрез наносят предположит специфич сыв-ку, комплемент морской свинки, контакт во влажной камере 30 мин т 37, препарат промывают, наносят ак сыв-ку, меч флюорохромн красит, контакт во влажн кам 30 мин т 37, промывают, микроскопируют под имм увелич люм микроскопа. (+ - свечение, - - тёмный фон). (ак сыв-ку получ набиокомб путём гипериммунизацией кроликов сыв крови или компл морск свинки. Для кролика она явл АГ, на кот выр АТ, это и есть ак сыв-ка, её метят фитцем, в реакции комплемента для неё будет являться АГ, вследствие обр комплекс, кот будет светиться благодаря фитцу)

Куриные эмбрионы, отбор, подготовка к заражению, применение.Преимущества: экономич выгода, не имеют своей иммунной системы, на вир не вырабат АТ, скорлупа предотвр проникновение в него бактерий и вирусов извне, не треб спец ухода.Условия: яйца для инкубации берут из благополучныз по заболеванию районов (хозяйств), яйца дб оплодотворены (пом в инкубатор, 3-4 суток инкубирования, в овоскоп, удал брак яйца), инкубируют не позднее 20 дней после оплодотв, яйца с белой скорлупой, дб чистыми (мыть нельзя).Применение: выделение вирусов из патмат, поддержание вирионов в усл лаб, биомодель для постановки РН, наработка вакцин.

33. Строение куриного эмбриона (рисунок), методы, техника заражения.Методы: на ХОА аболочку, в желточный мешок, в амнион, в тело эмбриона, в кровеносн сосуды (2 последних редко исп в связи с травматичностью)Техника заражения: В ХОА оболочку:1.Удаляют скорлупу в районе пуги, пинцетом приподнимают подскорл оболочку, шприцом вводят вируссод мат в объёме 0,2 мл, сверху одевают стекл колпачок, края парафинируют, чтоб воздух не проходил.2.Под контролем овоскопа опред границу пуги, выпил треугол отверст на границе пуги и ХОА об, пинцетом приподн подскорл об, внос вируссод мат.3.Под овоскопом опред место предлеж эмбриона, яйцо кладут горизонтально и со стор предлеж эмбр выпил квадратн отверстие, выруссод мат наносят на ХОА об, для этого параллельно верхней части пуги пробойником делают отверстие, при помощи груши отсас воздух из пуги, в рез-те обр искусственная пуга в районе выпил окошк, приподн подскорл об-ку, нанос вируссод мат. Большое отв заклеивают пластырем, маленькое – парафинируют.Заражение в ХАО полость:1.Под овоскопом отмечают границу пуги, пробойником дел отверстие в верхн части пуги и шприцом вводят вс мат на глубину 0,2 см ниже очерченной границы пуги, отверстие парафинируют.2.Под овоскопом опр место предлеж эмбр, яйцо кладут горизонтально в верхнем предлеж эмб, шприцом вводят вс мат в бессосудист участок на глубину 0,2 см.Заражение в желточный мешок:1.Под контролем овоскопа наход место предлеж эмбр, пробойником дел отверст в районе пуги, вносят шприцом вс мат под углом 45 градусов к месту предлеж эмбр на глубину 0,5 см, отверстие парафинируют.2. Горизонтально нижнему предлеж эмбр пробойником дел отверст в бессосуд полости и внос вс мат на глубину 0,5 см.Заражение в амнион:Удал скорлупу в районе пуги, приподн подскорлуп оболочку пинцетом, другим пинцетом захват амнион с эмбрионом, подтягивают его к краю яйца, вводят в амнион шприцом вс мат.Заражённые эмбр помещ в термостат, наблюд ведут в теч 3-4 суток. После гибели эмбр – в холодильник, затем вскрывают.

34.Понятие о культурах тканей.кт – участки клеточного роста в спец пит среде ин витро. Можно получить из любого органа и ткани животного и человека, поэтому можно не исп дорогостоящ лаб и естественно восприимч животных. Исп органы молодых жив-х и эмбрионы, тк вирусы лучше размножаются в молодых и интенсивно раст орг.Цели: выделение вирусв из патмат, поддерж вир в усл лаб, наработка вакцин, биомодель для пост РН и РГАд, титрование вирусов, изуч взаимод вируса с клеткой.Требования: макс стерильность, пасуда нейтральная, поддерж и ростовые среды (в составе – ср Игла, 199, р Хенкса, гидролизат лактатальбумина; в ростовой – сыв крови; индикатор фенолрот: красный цве – пш среды нейтральна, жёлтая мутная – бакпророст, жёлтая прозрачная – гибель клеток, малинов – зещелач посуда)Классификация: Переживающие, Растущие (плазменные, монослойные: первично-трипсинизир, субкультуры, диплоидные, перевиваемые)юТехника приготовления: Переживающие: готовят из орг и тк, кот измельч, отм от ФЭК ФБР, залив в спец пит среду, клетки во взвеш сост (Живые, но тер спос к пролиферации). Исп редко, против ящура)Растущие:1 Плазменные: орг и тк измельч, отм от ФЭК ФБР, во флакон внос плазму крови кур, пинцетом расп клетки в виде островков, для прикрепл – экстракт из кур эмбр (плазма сворачивается) или подогр дно до 45 град, залив рост среду, пом в термостат при т 37, через 2 суток – рост в виде пучков.2 Монослойные: расп в 1 слой. В частности:1.Первично трипсинизирванные: из люб орг и тк, 9-10 сут эмбриона, измельчают, отмыв от ФЭК ФБР, центрифугир (Ц), к осадку – 0, 25% трипсин, на магнитн мешалку на 30 мин при т 37. Трипсин расщипл кусочки тканей на отд клетки. Фильтруют через марлю, Ц в ФБР, р удаляют, осадок развод рост средой, доводя конц клеток до 40-80 тыс в 1 мл при пом кам Горяева. Клетки разлив по флаконам2.Субкультуры получ из перв трипс. Удал рост среду, сним монослой при пом р-ра версена, отмыв от р-ра путём Ц, к осадку доб трипсин, далее см. перв трипсин.3 Диплоидные: из перв трипс путём многократн пересевов на пит сред, клетки сохр жизнеспособн в теч 10 мес, потом – дегенерат измен и гибель4.Перевиваемые: из опухол или дипл после обр УФЛ и ультразвуком, дипл приобр св-ва злокач опухолей.

35.Превично-трипсинизированные кт. ЦПД вирусов.Первично трипсинизирванные: из люб орг и тк, 9-10 сут эмбриона, измельчают, отмыв от ФЭК ФБР, центрифугир (Ц), к осадку – 0, 25% трипсин, на магнитн мешалку на 30 мин при т 37. Трипсин расщипл кусочки тканей на отд клетки. Фильтруют через марлю, Ц в ФБР, р удаляют, осадок развод рост средой, доводя конц клеток до 40-80 тыс в 1 мл при пом кам Горяева. Клетки разлив по флаконам.ЦПД: после формирования монослоя удал рост среду, внос поддерж и доб вирус, помещ в термостат. Или с целью устран токсичности вируссод мат сначала могут внести вирус, ост на 1-2 часа, удалить вирус и внести поддерж среду. Флаконы – в термостат, кажд день – микроскопия под мал увел. через 2-3 суток в монослое обр пустоты, связ с ЦПД вируса. Флакон вынимают из термостата, удал поддерж среду, помещ в морозильн кам, где они сохр. При необходимости получ вируса флаконы 3 раза замор и размораж, доб ФБР и Ц, вирус – в надосад жидкости.

Серологическая диагностика вир болезней. Назначение, виды серолог реакций.В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела с образованием иммунных комплексов, которые можно обнаружить в тестах in vitro. Реакции: иммунодиффузии (диффузионной преципитации), иммуноэлектроосмофореза, связ комплемента,задержки гемагглют, непрямой гемагглют, задержки гемадсорбции, нейтрализации, иммунно-фрментн анализ.В реакциях обязат прин участ 2 компонента: АГ и АТ. АГ – чужеродное в-во белковой природы, кот в ответ на введение или попад в орг выз выработку АТ. Аг различ группоспецифич (для группы вирусов), штаммоспецифич. В кач АГ исп: пустулы и афты, надосад жид-ть, получ после Ц, мат, получ после заражен кур эмбр, культуральн жидк после термолизиса (в гомогенезатор, развод рост средой, титрование, разлив по флаконам, ампулам, высушивание). АГ мб живой и убитый (убита нк, а белк об ост)АТ выр органами имм сист (Т-клетками) в ответ на проникн в орг АГ.5 видов: A (сывороточн и секреторн – в железах); G (продуц после встречи М с АГ, при повторном проникновении АГ – сразу продуцир); M(перв встреч АГ, даёт маркеры для макрофагов); E(связ с гиперчувствит немедл типа);DРазличают АТ: комплементсвяз, преципитирующие, агглютинир, вируснейтрализующие.

37. Реакция диффузионной преципитации (РДП, РИД).Простая серологич реакц, прин уч 2 компонента: АГ и АТ (1 из них бывает неизвестен)Цель: идентифицир выделенный вирус и опред налич специфич АТ в сыв-ке.Ставят по методу Оухтерлони: при внесении АГ и сыворотки в агар, они диффундируют в его толще навстречу друг другу, в месте встречи – полосы преципитации серо-белого цвета.Методика: исп голодный агар фирмы Диффко (прозрачный), готовят из него 1% р-р и доб 0,5% NaCl, став на вод баню до полн распл агара, разлив по чашкам Петри, после застыв при пом спец пробойника дел лунки, оплавляют из на горелке для предупр подтек компонентов под толщей агара. В центр лунку – известный компонент (АГ или АТ), в периферич – неизв (АГ или АТ), на пов-то – комочек ваты, смоч дист водой, пом в термостат. Р учит через 24-48-72 часа. + - на границе между центр и порифер лунками – полосы преципитации.Контроли:1 с завед положит сыв и АГ, 2 с отр сыв и АГ.Ставят при диагностике лейкоза КРС, болезни Марека, инф.бруциальн болезни.

38. Реакция гемагглютинации.Не серологическая р.предложена Херстом в 1941 году (эритр цыплят склеив при добавлен к ним вир гриппа). Сущность: на пов-ти эритроцтов имеются рецепторы мукопротеидной природы, а на пов-тях гемагглют вирусов – АГ. При встреч АГ с эритр происх адсорбция вируса на пов-то эритроцита благодаря ферменту муциназе, причём вирус может адсорбироваться на пов-ти неск эр-тов. В рез адсорбции – «сеточка», однако р непродолжит, муциназа разруш рецепторы, расп на эритроцитах, кот осед на дно пробирки в виде пуговки.Компоненты: АГ и эритроциты.Цель: Выяснить, явл ли вирус гемаггл, опред титр вируса (идентифицир не можем, тк отсутств сыв-ка)Методика: Р став в плексиглаз планшетах. В лунки вносят по 0,2 см куб физраствора, в 1 лунку – вирус в развед 1 к 10, перемеш, перенос во 2, в 3, 4…(завис от предпол титра вируса), из последн лунки 0,2 см3 удал. Общий объём жидкости в пробирках – 0,2 см3. Затем в кажд лунку внос 1% эритроциты в объёме 0,2 см3. Р идёт при комнатной т 20-30 мин (в лунках в 1 – зонтик, в посл – пуговка). 1ГАЕ – макс развед вируса, при кот набл агглют 50% эритр. Планшетку накл, где агглют – там «слёзка».Контроль: физраствор + эритроциты.

39. Р. задержки гемагглютинации.Серологич р.: АГ, АТ, эритроциты.Цель: Идентификация, типизация, дифференциация вируса по диагностич сыв-кам, опред титра АТ в сыв-ке крови.Методика: в планшетки по 0,2 см3 физраствора, в 1 – 0,2 см3 сывортки, перемеш, далее – рд послед двукратн развед (завис от предполаг титра сыв-ки). Из послед лунки 0,2 см3 удал. В кажд – по 0,2 см3 вируса, должно сод 4 ГАЕ. Контакт 20-3- мин при комн т, затем в кажд лунку – по 0,4 см3 1% эритроцитов. Общий объём 0,8 см3. Можно исп микрометод – микродозы, аппликатор Токкачи, мал планшетки. Р учит через 20-30 мин (от пуговки до зонтика)Контроли: с завед положит сыв-кой, с отрицат, на самоагглют эр, ОБЯЗАТЕЛЬНО предворит став РГА.Диагностика: грипп, оспа, нью-касслская болезнь, с теми вирусами, кот обл гемаггл активностью или гемаггл АГ.

40. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)Ряд вирусов способны адсорбиров-тся на поверх-сти эритроц-тов не вызывая их склеивания ((происх. Сенсабилизация эритр-тов) и если к таким эритр-там сенсабилизированных вирусом + специфичес-ю сыворотку происх. Агглютинация эритр-тов при помощи Ат сыв-ки.
РНГА нужно отличать от РГА.
РГА – эритр-ты агглютинир-тся при помощи вируса.
РНГА – эритроц-ты агглют-тся благод-ря Ат.за счёт прекрепления Ат к вирусным частицам.
Цель: 1. Опред-ть титр сыв-ки и динамику его нарастания.
2. Идентифи-ть выдел-ый в-с.Компоненты: это серологическая р-я Эритроцитарный диагностикум с адсорбированным на нём в-сом. И ислед-я сыв-ка.Антиген-ый диагностикум получают на биокомбинатах, д\я этого исп. Эрит-ты чел-ка. Барана,петуха. Обрабатывают формальдегидо, затем тонином, затем проводят сенсабил-цию эритр-тов в-сом. Сенсабилизация-соединение массы эритр-тов с в-сом. Сенсаб-ные эритр-ты разливают по флак-нам и формир-ют наборы в сост. Кот входят кроме Аг-нного и эритр-ного диагностикума. Входят «+» и «-» сыв-ка.(упаковыв-ют и отправ-ют в лаб-рию.) в лаб-рии исслед-ые сыв-ки инактивир-ют(чтобы уничтожить ингибиторы белки задерж-щие р-ю), делают ряд послед-х 2-кратных разведений.(по 0,2)В кажд. Лунку + антиг. Эритроц-ый диаг-кум развед-ый в соот. С наставлением кот. Прилагается к кажд. Набору. Р-ю на когтакт 20 – 30 мин. Комнатн. t учёт рез-тов р-ции.В р-ции увидим зонтик потом пуговку.Контроли:1С заведомо «+» сыв-кой 2С зав-мо «-» сыв-кой.3Эритроц-ый диаг-кум+ физ. р-р на самоагглютинацию. д\я идентификации в-са на биокомбинатах нарабатывают Ат-ный эритр-ный диаг-кум где на эритр-ты адсорб-тся Ат. При постановке р-ии РНГА делают разведение в-са 2-ву кратно, а затем к ним + Ат-льный эрит-ный диаг-кум.

41. РГАд и РЗАГАдРГАд. Не серолог-я р-ия. Компоненты:1. Заражен-ыу в-сом культ-ры клеток.2. 0.5% эритр-ты.Цель: опр-ние результа-сти заражения культур тк. Ещё до проявления цитопатогенного действия в-сов.Методика: из флакона с зараж-ми культ. Кл. удаляют поддерж-ю среду и + 0,2 см3 эритр-тов 0.5% -х выставл-ем на контакт 10-15 мин.II вариант. – не удаляя поддерж-ю среду + 0,5% эритр-ты 0,2 см3 контакт 10-15 мин. Учёт рез-товр-ции под микроскопом.Эритр-ты адсорб-тся на поверх-ти кл. пораж-х в-сом(+ случай р-ии). В (-) случае – эритр-ты смоются,в поле зрения единичные эритр-ты..Контроль: 1. Эритр-ты +к незараж-м кул. Тк. РЗГАд.Серол. Р-ия основана на том что специф-я иммун-я сыв-ка способна нейтрол-ть гемадсорб-щее действие в-са.Компоненты:1Зараж. В-сом кул.тк.2Иссл-я сыв-ка.30,5% эритр-ты.Цель.: 1). Опред-ть наличие Ат в сыв-ке 2).идентиф-ть в-с с помощью диагностич-ой сыв-кой.из флак-ов удаляют поддерж-ю среду и +0,2 см3. Сыв-ки и + 0,8 см3. Р-ра Хэнкса. Контакт 30-40 мин. Затем удаляют р-р Хэнкса и +0.5% эритр-ты, контак 10-15 мин, рез-ты р-ии учит-ют под микроскопом.В «+» случае –эрит-ты плывут в поле зрения.(не адсорб-тся)В «-» случ. Адсорб-тся на поверх-ти пораж-х кл.Контроли: 1.)с «+» сыв-кой – плывут2) с «-«сыв. – адсорб-тся3)исп. Не зараж-ые в-сом кул. Тк- эрит-ты плывут в поле зрения.

42. РН. Реа-ция нейтрализации.-это эталонная р-ия.благ-ря ей оценив-ют правиль-сть получ-х рез-тов др серолог. Р-ций.эту р-ю ставят при диагностике почти всех вирус-х забол-й кроме: Африк. Чумы свин.(АЧС),Элиутск.болезнь норок, Лейкоз КРС,ИНАН лош.,СПИД.Сущ-сть р-ции:при попадании в-са в орг-зм в крови жив-х и птиц появл-тся вирус нейтрал-щие Ат. Затем при повторной встрече орг-зма с в-сом. в-с-нейтрал-щие Ат не дают в-су разви-ться и нейтрализ-ют его, тем самым чувств-ые биолг-кие модели не испытыв-ют пораж-го действия в-са.Цель: 1) опред-ть титр Ат в сыв-ке кр. И динамику его нарастания.2) идентиф-ция и дифферен-ция выдел-го в-са.Компоненты: 1) Аг(м\б как изв-м так и не известным).Аг перед р-цией титровать. И Аг д\б живой(обязательно)..2) Ат сод-ться в сыв-ке кр. м\б извест-ной, и неиз-ой – её инактив-ют..3) чувст-ая биолог-я модель.(кул.тк, эмбрионы,лаб.жив-ные).Схема постановки р-ции.:1)Изв. В-с +неизв сыв-каДелают ряд послед-х разведений в-са(10кратных) и + постоянный V неизв. Сыв-ки.2)изв. Сыв-ка + неизв в-с – ряд послед-х разведений сыв-ки и +постоян-й V неиз в-с. В обоих вари-тах смесь сыв-ки с Аг выдер-ют 1-2ч. При t 37 С градусов. Или в течении 18 ч. При t(+4)С.В кажд. Из получ-х разведений заражают по 3-4 биол модели.Наблюдение за ними ведут в теч 5-12 сут и опр-ют за это время ЭД50.Р-ю опр-ют по м-ду Рида-Менча: опр титр в-са в смеси с норм сыв-кой. И в смеси с «+» сыв-кой. Затем высчит-ют индекс нейтрализации кот=отношению титра в-са в смеси с норм сыв к титру в-са в смеси с «+» сыв. И за «+» р-ю приним-ют индекс нейтр-ции кот =2 и более логарифмам, а за «-» 1 и менее лог-в.

43. ИФА.Исп-ют как д\я опр-я неизв Аг так и неизв Ат.Ставится 2мя м-дами: 1)гистохимический.2)твёрдофазным.1.Ат обраб-ют ферментами пераксидазы хрена а выяв-ют с помощ спец субстрата:5ть аминосалициловой к-ты и т.д. суб-рат под дейс-ем фер-та распад-тся образ-я цветной ряд ферментации, улавливают это в обычн микроскоп,м\ и визуально.Гистохимический м-д: прямой и непрямой м-ды.Прямой: на фиксир мазок зараж в-сами наносят специфич-ю сыв-ку в кот Ат обраб-ны ферментом пероксидазы хрена. Контакт во влаж-ой камере в термостате 37 С, 1-2ч. Промыв-ют физ р-ром. Сполас-ют дистил водой, сушат на в-хе и наносят неск капель субстрата, контакт 5-10 мин. Промыв-ют физ р-ром см в обыч-ый микроскоп. В + случае – голуб окрашивание кот потом переходит в коричневый цв.Непрям м-д.:на фик мзок зараж в-сом наносят специф-ю сыв сод-щую Ат.Контакт в термостате 1-2ч. 37 С - промыв-ют физ р-ром – сушат на в-хе и наносят антивид-ю иммун-ю перокси-ный каньюга-в термостат 1-2ч 37С контакт-ют.-промыв физ р-ром – сушат на в-хе-+неск капель субстрата 5мин- промыв физ р-ром – см в микроскоп – картинка таже.Твёрдофазный м-д: при нём исп микропанели с лунками в них + 0,2 мл гаммаглобулина получ-го из сыв сод Ат против предполаг-го воз-ля, контакт в термостате 1ч 37 С- затем целую ночь выдерж-ют в холодтльнике 4С утром выним-ют промыв буферным р-ром и вносят в-с-сод Аг 0,2 мл – 1-2ч 37С промыв буфер р-ром и +специф антивид-ой иммуноферментный канюга 1-2ч 37С терм-стат – промыв буф р-ром + субст-рат контакт 5-30 мин в тёмном месте при комнат t – см: если желт-оранж-я – «+», если нет окрашив-я «-», д\я контроля во всех м-дах исп зав-мо «+» и завед-мо «-»сыв-ки.

44. ПЦР-это амплификация ДНК инвитра с помощ ПЦР м\разм-ть опред-ую после-ть ДНК многократно в 100, 1000 иболее раз.Компоненты: 1)ДНК матрица кот имеет спецмф-ий фрагмент свойсв-ный только д\я данного орг-зма(м\о,в-са и т.д.). 2)праймеры это синтетич-е олигонуклеотиды, комплем-ые ДНУ на опр-х уч-ках этого фраг-та. 3) смесь дезоксинуклеотидтрифосфата кот явл мат-лом д\я синтеза нов ДНК и спец-ий ферм-нт тат-полимераза.(катал-ет послед-ное присоединение нуклеотид-х основ-ий к растущей цепи ДНК. Кажд цикл вкл 3 этапа:1) расплетение ДНК 2)присоединение праймеровна границе специф-го уч-ка напротивопол-х частях ДНК(t 66С 20 сек)3)достраивание цепей ДНК в противопол-х напрвлен-ях с уч-ков присоед-я праймеров. Катал-ется тат-полимеразой. Образ-тся специф-й фрагмент ДНК – наз. Ампликон. В дальнейшем он служит д\я синтеза нов цепей ДНК поэтому получ-тся бол кол-во иском-х цепей.

45. Титрация в-сов. Титр в-са и метод-ка опред-я титра в-сов. Ед. измерения титра в-сов.После того как сформир-тся монослой удал-ют ростов среду + поддер-ю и к + в-с и в термостат.Затем в-с удаляют и + поддерж-ю среду. После заражения в термостат и каж день проводят их микроскопию под малым увелич-ем микроскопа.ч\з 2-3сут в монослое поя-тся пустоты связанные с цитопатогенным дейст-ем в-са на кл-ки. После этого флаконы вынимают из термостата удаляют поддерж среду и помощают их в морозильную камеру где они и сох-тся. титрование в-са Цель: 1. Определ-е конц-ции в-сов в среде, 2. Титров-ние проводят при наработке вакцин, 3. При получении Аг д\я серол-х р-ий.. 4 с целью потбора точных доз д\я заражения лаб жив-х.Титр –это количество вирусов в ед. объема (обычно в 1 мл) суспензии.(мат-ла). Подсчитывают в электронном микроскопе или методом бляшек (см. Бляшки) на к-ре клеток. В первом случае выявляют все вирионы, во втором – только инфекц.; 2) количество инфекц. ед., содержащихся в 1 мл вирусной суспензии. Определяют путем заражения 10-кратными разведениями материала животных, КЭ, к-р клеток. За титр вируса принимают наибольшее разведение, вызвавшее локальное или общее поражение тест-системы. В том и другом случае титр вируса выражают в виде десятичного логарифма.Наиб универ-ым явл м-дом опред титра в-са в ед 50%ифекционного действия. За ед-цу кол-ва в-са берут дозу кот способна вызв-тьинф-ый эфф-кт у 50%зараж-х жив-х. (ЭД50.).1 ЛД50-доза в-са убив-я 50 лаб жив,1ИД50-з в-са вызыва-я клинич-е симптомы или патологоанатомич-е измененияу 50%зараж лаб жив. 1ЭЛД50-д в-са. убива-щая 50% кур эмбрионов, 1ЭИД50-д в-савызыв-я изменения у 50% зараж-х кур эмбрионов, 1ЦПД50-д в-са вызыв-я цитопатический эфф-кт у 50% зараж кул клеток.

46. РСК.Сложн-я серол-я р-я. Ставят при диаг-тики ящура,чумы плотояд-х, гепатит плотояд-х.Приним-ют участие 2 сист и 5 компонентов. 1 сист – тест сист Аг,Ат,комплемент, 2 сист-индик сист – гемолизин,эритр-ты барана.Компоненты: Аг –м\б изв (разраб-ют на биокомбин-х) и неизв-ый (жив или инактив-ый).Сыв-ка извест – на биокомбин-х, и неизвестн-я её инактивируют при 55-60С в теч 30мин. Комплемент –литическое в-во белков природы, кот способ-но присоед-тся к комплексу Аг+Ат. Получ-ют от самцов морск свинок- лиофильно высушенный. Гемолизин – гемолит-я сыв-ка на биокомб-х путём гипериммуниз-я кроликов эритр-ми барана. Эритр-ты барана – в лаб-рии.Треб к р-ции: 1. Сыв д\б инактевированна. 2. Р-ю ставят в строгой после-сти:тест сист –вод баня 20мин 37С +гемм сист в вод баню на 30мин. 3. Кажд компонент вносят по 0,2 см3.в рабоч-х титрах. 4. Общ Vжидк-сти в проб = 1 мл или см3. 5. Физ р-р свежий без консервантов.Сущ-сть р-ции: 1. Если Аг и Ат специф-ны = обр-тся их комплекс и происх-т прис-ние к комплексу комплемента лизируя комплекс. Гемм сист эрит-ты и гемолизин всегда специфичны –обр комплекс но нет комплемента, не лизир-тся и оседает на дно проб-ки – прозр надосадочн жид-сть. 2. Если Ат и Аг не спец-ны комплекс не образ-тся свободн комплемент присое-тся к гемм сист и лизир-ет эритр-ты- столбик жид-сти красн прозрачн-й. Ставят главн опыт РСК. В 2 –х вариантах.:1.Если неизв Аг – исп нативный Аг неразвед-й т.е 1:2,1:4,1:8 + сыв-ка+комплемент в вод баню +гемм сист и на вод баню. 2. Если неизв сыв-ка – исп натив сыв-ку в развед-ии 1:2, 1:4, 1:8 +Аг диагностич + компл-т в вод баню + гем сист и на вод баню. Р-ю учитывают сразу и ч\з 2ч. После.Учёт рез-т: 100% ++++- на дне осадок из эрит-тов75%+++- осадок, желтоватая жидк-сть50%++-небол осадок. Столбик розовый25%+-остаток эритр-в, красн жид-сть«-» -полный гемолиз красн жидк-сть. На ++ и более – р-я счит-тся положит-ой. Контроли: Аг+Ат(сыв+Аг)- «+»-100%+сыв+физ р-р - «-» Аг+физ р-р – «-»

47. м-ды очистки и концентрации в-сов.Тельца-включения и м-ды их окрашив-я с исп свет микроскопии.В вируссод-м мат-ле в-в мало. д\я того чтобы их выделить в чистом виде н\удалить балластные в-ва. Цель: 1)д\изуч-я морфологии вир-в. 2) д\заражения ЧБМ.3) д\наработки Аг д\серолог р-ий 4) д\наработки вакцин.М-ды очистки и конц-ии. I. Физич-е: 1-термолизис(3 р замораживают и размораж-ют пат мат.) 2- м-д мембранных фильтров (мат-л пропуск ч\з бак фильтр затем ч\з мембр фильтр затем фильтр измельч-ют и помещ-ют в центрифужн-ю пробир-ку затее уентриб-ют 3 тыс оборотов 20 мин в-с в надосад жидк-сти). 3-ультрацентрифугирование основан на разделении ч-ц по массе в-с сод мат-л в физ р-р и центр-ют при 3-4 тыс оборотах/мин. надосад-ю жидк-сть разводят физ р-ром и центриф-ют при5-6 тыс обор\мин. 20 мин. Желательно чтобы цент-га была с охлаждением. Надосад-ю жидк-сть + физ р-р помещ в ультрацентр-гу и центриф-ют при 60 тыс об\мин. – в-с на дне. 4- м-д седиментации в градиенте плотности(разделение ч-ц по скорости оседания в вязк среде, исп 60% сахарозу). 5- м-д адсорбции с послед-щей аллюцией.(в-сы м\адсорб-тся на пов-сти разл кл-ок, на гипсе, гидроокисе Al, эритр-тах. В-с гриппа адсор-тся на эритр-тахпри +4С – центриф-ние-+в-с + эритр-ты –на дно –центриф-ние повторно-в-с в надосадочн.жид-сти.II.Химические (в-сы всегда в осадке)центриф-е проводят 20мин при 3-4 тыс об\мин 1) с исп метанола: к в-ссод-му мат-лу + по каплям метанол до его конц=25%, при+4С 2-4ч- центриф-ют. осдадок разводят фосфатным буфером. 2)Седиментация в изоэлектрич точке. У все в-сов изоэл-я точка нах в диапазоне 3,5-6,5 pH к в-ссод-му мат-лу по каплям + 1н. р-р HCl +4 ч при 4С центриф-ют в-с в осадке+ слабощелочн-ой фосфатный буфер. 4) осаждение солями и полиэтиленгликолем. Исп чаще (NH4)2SO4-доводят до конц=3,5%, а полиэтиленгликоля до 7,5%-2-4ч,4С-центриф-ют.. 5) м-д Ильенко: исп д\я в-в кот имеют тропизм к тк ГМ. В-ссод мат-л смешив-ют с эфиром или хлороформом, тщат-но перемеш выдержи-ют 2ч,4С и центрф-ют. там где был эфир – в-с в осадке,а где хлороформ – в-с в надосад-ой жид-сти. III Биологические: 1)АБ, 2) накаплив-ние в-са в кур эмбрио-х,кул кл-ток, в злок опухолях. Тельца включ-я образ-ют в-сы оспы, гепатита плотояд-х, бешенства. Пат мат-л: объекты для свет микроскопии 1-мазки,2-мазки –отпечатки,3-гистосрез.Фиксир-ют чаще хим м-дом(ж-ть Никифорова, ацетон) – затем окраска по м-дам Михина и Муромцева. 1) муромцева: фикс мазок+синька мансона на 10мин в р-р тонина-промыв и сушат- в р-р спирт+ксилол или спирт+ацетон -и микроскопия. Картинка: Тельца- вкл-я –фиолетовые,цитопл-зма- голуб-я, ядра-синие. 2)михина: на фикс мазок +краска РГ на 10-15 мин-промыв-ют подкисл-м спиртом- промыв дист водой – сушат – микроскопия. Картинка: цитоп-зма- красная, ядра-чёрн., тельца- темно-синие.

Поиск по сайту: