Глава 4.3. Механизмы детоксикации и выведения ксенобиотиков

Ксенобиотики делятся на несколько групп: 1) вещества бытовой химии (моющие средства, косметика, инсектициды); 2) продукты хозяйственной деятельности человека, образующиеся в промышленности, сельском хозяйстве, на транспорте; 3) большая часть лекарственных препаратов.

Липофильные ксенобиотики в настоящее время вызывают особенное внимание экологов и токсикологов, так как, накапливаясь в жировых тканях, способны переходить по пищевой цепи в организмы животных и человека, превращаясь в более полярные и, следовательно, более легко усваиваемые или экскретируемые вещества.

Ухудшение экологической обстановки способствует возрастанию поступления ксенобиотиков в организм живых существ, что угрожает их здоровью, а иногда и жизни, так как вызывает повреждение клеток и мутации, приводящие к злокачественным процессам или наследственным заболеваниям.

Для снижения токсичности чужеродных веществ в результате эволюции в организмах были созданы многочисленные механизмы защиты от действия ксенобиотиков. Они включают в себя:

1) систему барьеров, препятствующих проникновению ксенобиотиков во внутреннюю среду организма и защищающих важные органы − мозг, половые и некоторые другие железы внутренней секреции − от тех чужеродных веществ, которые все же прорвались во внутреннюю среду;

2) особые транспортные механизмы для выведения ксенобиотиков из организма;

3) ферментные системы, превращающие чужеродные соединения в вещества менее токсичные и легче удаляемые из организма;

4) тканевые депо (жировая, костная ткани), где могут накапливаться и храниться длительное время ксенобиотики;

5) иммунную систему, реакции которой направлены против генетически чужеродных веществ.

Системы выведения ксенобиотиков, к сожалению, не всесильны. При высокой концентрации ксенобиотиков в крови все молекулы переносчика в мембране клетки живого организма будут заняты, и процесс переноса будет идти с определенной скоростью. Некоторые загрязнители, как выяснилось, могут повреждать и нарушать транспортные пути выведения вредных веществ. Это приводит к избирательному накапливанию вредных веществ в определенных тканях живого организма.

Зная механизмы детоксикации чужеродных веществ и принципы работы ферментативных систем, человек может эффективно бороться с негативными воздействиями загрязненной окружающей среды и научиться обходить системы защиты организма для предотвращения инактивации лекарственных препаратов.

4.3.1. Негативные воздействия ксенобиотиков на клетки организма и общие проявления интоксикации. В настоящее время известно пять основных механизмов, ведущих к гибели клетки, они могут быть запущены при воздействии на клетку чужеродных веществ.

1. Повреждения плазматической мембраны: непосредственные через порообразующие белки (система комплемента, перфорин цитотоксических лимфоцитов), опосредованные через действие на элементы цитоскелета (кальций-независимая стабилизация актина, кальций-зависимые диссоциация нитей актина и активация нелизосомальных протеаз, расщепляющих актинсвязывающие протеины). Эти повреждения сопряжены с перекисным окислением липидов и истощением запасов АТР.

2. Нарушения функций митохондрий. Повреждение системы окислительного фосфорилирования и митохондриальной мембраны, стимуляция АТР-потребляющих метаболических путей приводят к уменьшению концентрации АТР в клетке и понижению рН в митохондрии, что способствует инактивации деградирующих ферментов и закрыванию ионных каналов. Повреждение митохондриальной мембраны вызывается перекисным окислением мембранных липидов и действием фосфолипазы. Возможно воздействие на митохондриальную ДНК.

3. Нарушения внутриклеточного ионного гомеостаза. Высокореакционноспособные молекулы изменяют работу ионных каналов путем ковалентного связывания с белками, образующими ионные каналы, окисления SH-групп этих белков. Увеличиваются входящие токи натрия и кальция и выходящий ток калия. Наиболее важное значение имеет повышение концентрации кальция, которое происходит за счет высвобождения его из эндоплазматического ретикулума и увеличения проницаемости плазмолеммы. Ионы кальция активируют многие ферменты. Эти изменения также сопряжены с повреждениями мембран, дисфункцией митохондрий и перекисным окислением мембранных липидов.

4. Активация ферментов деградации веществ: протеаз, фосфолипаз, нуклеаз и т. д. - имеет место при АТР-голодании, окислительных повреждениях клеток.

5. Высвобождение свободных радикалов. Образование супероксидного радикала О₂^•происходит благодаря действию ксантиноксидазы, циклооксигеназы и липооксигеназы (синтез эйкозаноидов), монооксигеназ, а также при нарушениях в цепи переноса электронов в митохондриях. Гидроксильный радикал ОН^• способен повреждать ультраструктуру ДНК и белков, инициировать (наряду с ионами железа) перекисное окисление липидов. К реакционноспособным соединениям подобного действия относят также перекись водорода Н₂О₂, гипохлорит СlO^-, хлорамины RSO₂NH₂, синглетный кислород О^•, пероксирадикалы ROO^•.

4.3.2. Метаболизм ксенобиотиков. Метаболизм ксенобиотиков направлен на снижение их активности, а значит и их токсичности. Но иногда метаболиты ксенобиотиков становятся более активными и даже более токсичными.

В метаболизме ксенобиотиков различают три фазы, которые приводят к увеличению гидрофильности молекулы, снижению активности и токсичности (рис. 4.24). Первая фаза метаболизма чужеродных

Рис. 4.24. Метаболизм и выведение ксенобиотиков из организма: КсБ - ксенобиотик, R - конъюгированный остаток (глутатиона, глюкуроновой кислоты, сульфата и т. д.), Гфб - гидрофобные и Гфл - гидрофильные метаболиты ксенобиотиков, М - молекулярная масса (согласно [2])

веществ заключается в модификации, создающей или высвобождающей функциональные группы, которые во второй фазе конъюгируют с другими группами или молекулами. Третья фаза - связывание и выведение ксенобиотиков и их метаболитов из клетки и из организма. Превращаясь в гидрофильные соединения, часть ксенобиотиков выделяется с мочой. Более гидрофобные или обладающие бо-

Рис. 4.25. Локализация монооксигеназной системы в липидном бислое эндоплазматического ретикулума. CYP - цитохром Р450 и NADPH-зависимая цитохром Р450 редуктаза заякорены в мембране N-концами. Активные центры ферментов, локализованные ближе к С-концам, экспонированы в цитозольный компартмент (согласно [29])

льшой молекулярной массой (> 300 kDа) вещества попадают в кишечник с желчью и удаляются с калом.

4.3.2.1. Первая фаза метаболизма ксенобиотиков. Эта фаза обусловлена работой, главным образом, микроcомальной системой метаболизма или монооксигеназной системой, локализованной в основном в мембранах эндоплазматического ретикулума, в основе которой лежит система цитохрома Р450 (рис. 4.25).

Главная задача этой системы заключается в образовании функциональных гидрофильных групп. К достоинствам этой системы можно отнести ее локализацию и высокую мощность работы на главных путях поступления ксенобиотиков (пищевом и дыхательном), а также многообразие метаболических реакций, осуществляемых данной системой. К этим реакциям относятся реакции окисления, восстановления и гидролиза.

1) Гидроксилирование (бензол, фенол, полициклические ароматические углеводороды - ПАУ, барбитураты).

С₆Н₆ + NADPH + Н⁺ + О₂ ® С₆Н₅ОН + NADP⁺ + Н₂О

С₆Н₆ОН + NADPH + Н⁺ + О₂ ® С₆Н₅(ОН)₂ + NADP⁺ + Н₂О

фенол пирокатехин

Барбитураты могут гидроксилироваться по ароматическому кольцу с образованием фенолов, а в результате a-окисления - по боковым цепям. н-Пропилбензол (С₆Н₅СН₂СН₂СН₃) может превратиться или в этилфенилкарбинол (С₆Н₅СНОНСН₂СН₃) в результате a-окисления, или в бензойную кислоту (С₆Н₅СООН) в результате w-окисления.

2) Окисление по сере и азоту (аминазин, никотин, аминофлюорен). В результате окисления атома азота могут образовываться гидроксиламины, оксимы и N -оксиды.

N -оксиды образуются при окислении первичных, вторичных и третичных аминов, но цитохром Р450 способен окислять только первичные амины. Для некоторых соединений, например никотинамида, основной путь метаболизма - это образование N -оксида.

Окисление по атому серы приводит к образованию сульфоксидов, например: хлорпромазин (аминазин) ® хлорпромазинсульфоксид.

3) Эпоксидирование (ПАУ, например бенз(а)пирен или нафтален). Эпоксид, возникающий в процессе метаболизма, может подвергаться неферментативному гидролизу с образованием нафтанола либо, взаимодействуя с эпоксидгидролазой, превращаться в дигидродиол.

.

В ходе биологического окисления ароматических углеводородов в клетках инициируются свободно-радикальные процессы, образуются ареноксиды, формирующие ковалентные связи с нуклеофиль-

ными структурами клеток (белками, нуклеиновыми кислотами и т. д.) и активирующие перекисное окисление липидов клеточных мембран. Ареноксиды могут вызывать некроз клеток и являются канцерогенами.

4) Окислительное деалкилирование по азоту (морфин, аминопирин) (а), кислороду (кофеин, колхицин) (б), сере (6-метилтиопу- рин) (в, г).

(а)

(б)

(в)

RSCH₃ ® RSH + HCHO (г)

N -деалкилирование (чаще всего деметилирование) является основным способом метаболизма вторичных и третичных аминов и изучено подробно на примере наркотиков и анальгетиков. Так, деметилирование морфина по азоту приводит к образованию норморфина и альдегида. По пути О -деалкилирования преобразуются в печени кодеин, колхицин, папаверин. В результате О -деметилирования кодеина образуется морфин, на чем основано обезболивающее действие кодеина.

5) Окислительное дезаминирование. Отщепление аминогруппы от лекарственных препаратов чаще всего приводит к потере фармакологического эффекта, например окислительное дезаминирование в микросомах печени амфетамина (С₆Н₅СН₂СНNH₂CH₃) с образованием фенилацетона (С₆Н₅СН₂СОCH₃).

6) Окислительное дегалогенирование.

7) Восстановление нитро- (нитробензол, левомицетин) (схема 6) и азосоединений (азокрасители) (схемы 7 и 8).

Реакции восстановления протекают в эндоплазматическом ретикулуме в присутствии NADPН-зависимого флавопротеина и цитохрома Р450 (например, восстановление хлорамфеникола до 1-n-аминофенил-2-дихлор-1,3-ацетаминопропандиола). Восстановление же нитробензола в анилин осуществляется микросомальной NADН-зависимой системой, представляющей собой флавопротеин с FAD в качестве простетической группы (схема 6).

NO₂C₆H₅ + NADH + Н⁺ ® NН₂С₆Н₅ + NAD⁺ + Н₂О

8) Десульфирование (тиобарбитал, паратион). Реакция десульфирования, т. е. замещение серы кислородом, протекает также при участии цитохрома Р450.

К наиболее распространенным реакциям биотрансформации ксенобиотиков относят реакции окисления. Поскольку эти реакции протекают чаще всего в микросомах, то речь идет о микросомальном окислении. Наиболее часто встречающаяся реакция микросомального окисления - гидроксилирование ксенобиотика, протекающее по типу монооксигеназной реакции. Микросомальная окислительная система многофункциональна и осуществляет восстановление до воды одного атома кислорода и внедрение второго атома кислорода в молекулу субстрата согласно схеме 9:

2S + 3DH₂ + 2O₂ ® 2SOH + 3D + 2H₂O, (9)

где S - окисляемый субстрат, DH₂ - донор электронов для активации кислорода.

4.3.2.2. Микросомальные ферментные системы. Реакции микросомального окисления катализируются NADPH- и NADH-зависимыми ферментными системами в присутствии кислорода.

Электрон от восстановленного NADPH на цитохром Р450 переносит NADPH-зависимый флавопротеин. В монооксигеназных реакциях принимает участие также и NADH-зависимый ферментный комплекс, состоящий из NADH-зависимого флавопротеина и цитохрома b ₅. Электрон с цитохрома b ₅ может переноситься или на кислород с его активацией, или на цитохром Р450, восстанавливая ион железа в геме. NADPH-зависимый флавопротеин - это димер с молекулярной массой 40,5 kDa, содержащий одну молекулу FAD на каждую субъединицу. Цитохром b ₅ - мономер с молекулярной массой 13 kDa.

Ключевым ферментом системы микросомального окисления выступает цитохром Р450 (К.Ф. 1.14.13.1 и 1.14.14.1), представляющий собой мономер с молекулярной массой от 44 до 60 kDa и содержащий одну геминную группировку (рис. 4.26).

Рис. 4.26. Структура цитохрома Р450 человека CYP2C9 (N-конец располагается слева, рядом с цифрой 1, С-конец рядом со спиралью D). Активный центр локализован в щели между спиралями В и С, F и G, внутри него схематически изображен гем - протопорфирин IX (согласно [29])

Связывание субстрата с цитохромом Р450 запускает реакцию субстратной биотрансформации. Субстрат может связываться как с белковой частью цитохрома Р450, так и с ионом железа геминной группировки фермента.

Цитохром Р450 представляет собой семейство ферментов. В настоящее время известно более 150 различных цитохромов Р450, обнаруженных в животных, растениях, грибах, бактериях. В некоторых тканях присутствует несколько различных изоформ цитохрома Р450. Встречаются тканеспецифичные формы ферментов. Наличие специфических форм цитохрома Р450 обусловлено генетическими механизмами, а повышение содержания в тканях различных изоферментов индуцируется действием на организм различных ксенобиотиков: лекарств, ядов, токсикантов. Цитохромы Р450 подвержены не только активации, но и инактивации, как исходными ксенобиотиками, так и их реактивными метаболитами.

Цитохромы Р450 обладают низкой субстратной специфичностью, вызывая превращения веществ самого разного строения, и потому часто называются оксидазами со смешанной функцией (ОСФ). Цитохром Р450 относится к группе цитохромов b, активно связывающих монооксид углерода. Название "цитохром Р450" фермент получил в силу того, что максимум поглощения света пигментом, связанным с СО, осуществляется при длине волны 450 нм. Цитохром Р450 катализирует окисление практически всех классов органических молекул. Субстратом для этого фермента могут быть и простые молекулы типа хлороформа и стероиды и сложные гетероциклические соединения, например антибиотик циклоспорин. Цитохром Р450 могут катализировать не только окисление, но и восстановление некоторых биосубстратов, например четыреххлористого углерода, некоторых других галогенсодержащих углеводородов с образованием свободных радикалов. Такое необычное превращение реализуется в условиях пониженного парциального давления кислорода в тканях.

Основные закономерности протекания ферментативных процессов с участием микросомального монооксигеназного комплекса, состоящего из цитохрома Р450, NADPH-цитохром Р450 редуктазы, простетическими группами которой являются FAD и FMN, и фосфолипидов биологических мембран, в которые встроены оба фермента, представлены на рис. 4.27.

Гем в ферменте может находиться или в восстановленной (ферро) или окисленной (ферри) форме. Из рис. 4.27. видно, что превращение ксенобиотика при участии монооксигеназной системы происходит в несколько этапов. На начальном этапе субстрат (S) вступает во взаимодействие с ферриформой железа цитохрома Р450.

Рис. 4.27. Схема превращения субстрата при участии цитохрома Р450

В ферри-форме гема существует равновесие между двумя состояниями: низкоспиновым (S = 1/2) шестикоординируемым и высокоспиновым (S = 5/2) пятикоординируемым (рис. 4.28). В низкоспиновом состоянии ион железа лежит в плоскости пиррольных колец, шесть лигандов занимают вершины октаэдра, в этом состоянии вступление в реакцию иона железа затруднено. В случае высокоспинового состояния диаметр иона железа больше, он не помещается в плоскости порфиринового кольца, а выступает из нее, теряет один из заместителей (Y) и легко вступает в реакции восстановления (см. рис. 4.28).

К комплексу ферри-форма цитохрома Р450 - субстрат с помощью NADPН-зависимого флавопротеина цитохром Р450 редуктазы присоединяется электрон, донором которого является восстановленный NADPН. Ион железа цитохрома Р450 при этом восстанавливается из степени окисления 3+ в 2+. После этого комплекс взаимодействует с кислородом, образуя трехкомпонентную систему. После взаимодействия со вторым электроном (донор - NADPН-зависимый цитохром b ₅) происходит активация связанного с цитохромом атома кислорода, который приобретает способность связывать протоны и образовывать воду. Образовавшаяся при этом форма цитохрома Р450 гидроксилирует субстрат, давая свободный цитохром Р450 с окисленным ионом железа, готовым принять участие в новых циклах окисления. Данный механизм имеет циклический характер, что позволяет цитохрому Р450 многократно участвовать в реакциях гидроксилирования.

Рис. 4.28. Спиновые состояния иона железа в геминной группировке цитохрома Р450: а - низкоспиновое (S = 1/2); б - высокоспиновое (S = 5/2) (согласно [29])

В зависимости от типа катализируемой реакции (гидроксилирование, эпоксидирование, деформилирование альдегида) образующийся комплекс гема с кислородом может выступать как электрофильная или нуклеофильная частица. На рис. 4.29. представлены промежуточные производные комплексов гема с кислородом: феррипероксианион, как нуклеофил участвующий в реакции деформилирования альдегидов, ферригидропероксипроизводное, реагирующее и как электрофил, так и как нуклеофил, оксиноид железа, выступающий в качестве электрофильного реагента в реакциях эпоксидирования и гидроксилирования.

Поскольку цитохром Р450 - гемопротеин, его активность регулируется процессами синтеза гема, т. е. связана с метаболизмом железа. Нарушение метаболизма, голодание, понижение соотношения NADPН/NADP⁺ могут приводить к снижению активности цитохрома Р450.

Рис. 4.29. Промежуточные производные комплексов гема с кислородом, обнаруженные в цитохромах Р450.

Ксенобиотики окисляются не только монооксигеназной системой цитохрома Р450, но и некоторыми другими ферментными системами, к которым относятся:

1) микросомальные флавинсодержащие монооксигеназы, катализирующие окисление вторичных и четвертичных аминов, гидразинов, серо- и фосфорсодержащих соединений;

2) микросомальные и цитозольные алкоголь и альдегиддегидрогеназы, окисляющие спиртовую и альдегидную группы до альдегидов и карбоновой кислоты соответственно;

3) системы пероксидаза-каталаза, катализирующие окисление органических соединений (фенолов, гидрохинонов и аминов), в том числе и этанола;

4) аминооксидаза, катализирующая окисление аминов до альдегидов;

5) ксантиноксидаза, окисляющая ксантин и родственные соединения до мочевой кислоты;

6) окислительное дегалогенирование (замещение, например хлора в ксенобиотике на кислород).

Микросомальные флавинсодержащие монооксигеназы (ФМО, К.Ф. 1.14.13.8)) наряду с цитохромом Р450 являются существенными ферментными системами, участвующими в метаболизме ксенобиотиков. В отличие от цитохрома Р450 ФМО конститутивные белки не подвергаются индукции. Очень часто ФМО используют те же субстраты, что и цитохром Р450 (например, амины, сульфиды, в том числе метионин и липоевую кислоту, фосфор- и селенсодержащие соединения). Субстраты при этом должны быть нейтральными веществами или нести один положительный заряд. Анионы, дикатионы или цвиттерионы с помощью ФМО не метаболизируются. На рис. 4.30 представлен каталитический цикл ФМО.

Рис. 4.30. Каталитический цикл флавинсодержащих монооксигеназ (ФМО): а - восстановление простетической группы ФМО - FAD с помощью NADPН до FADН₂; b - присоединение молекулы кислорода к FADH₂ с образованием гидроперекиси, связанная в комплексе NADP⁺, стабилизирует 4а-гидропероксифлавин; c - нуклеофильный субстрат Х атакует атом кислорода с образованием окисленного продукта ХО и 4а-гидроксифлави- на; d - 4а-гидроксифлавин, высвобождая молекулу воды, переходит в окисленную форму FAD; е - гидролиз комплекса FAD-NADP⁺ заканчивает каталитический цикл ФМО (согласно [29])

Простетической группой ФМО является FAD. На первой стадии реакции NADPН, играющий роль кофермента в данной реакции, восстанавливает FAD до FADН₂, но остается связанным в ферментном комплексе (рис. 4.30, а), так как стабилизирует переходное состояние фермент-субстратного комплекса. На следующей стадии молекула кислорода присоединяется к простетической группе по положению 4а с образованием гидроперекиси - 4а-гидроперокси-флавина. Первые две стадии протекают быстро. В отсутствие субстрата промежуточное соединение FADН-ООН стабильно, но может распадаться с выделением супероксидного радикала или Н₂О₂ в зависимости от окислительно-восстановительного потенциала клетки. В присутствии нуклеофильного субстрата Х происходит атака на атом кислорода, который переносится на субстрат с образованием окисленного продукта (рис. 4.30, с) и 4а-гидроксифлавина. Последнее соединение переходит в окисленную форму флавина после выделения молекулы воды, эта стадия является скорость-лимитирующей стадией всего процесса, катализируемого ФМО. На последней стадии (рис. 4.30, е) происходит освобождение NADP⁺ из ферментного комплекса.

В отличие от цитохрома Р450, который предпочтительно метаболизирует первичные амины, лучшими субстратами ФМО являются третичные амины. Вторичные амины окисляются обеими ферментными системами медленно.

Цитозольная алкогольдегидрогеназа (АDН, К.Ф. 1.1.1.1) представляет собой димер, содержащий ионы Zn, предпочтительно окисляет первичные спирты, на третичные спирты не действует. Фермент встречается в множественных формах, его активность индуцируется этанолом и ингибируется альдегидами, и генетически связан с алкоголизмом. Микросомальная и цитозольная альдегиддегидрогеназы (ALDH, К.Ф. 1.2.1.3) встречаются ввиде димеров или тетрамеров. Реакция, катализируемая АDН, обратима, а вторая реакция (ALDH) нет. В качестве кофермента оба фермента содержат NAD⁺ / NADP⁺.

RCH₂OH + NADP ⁺ ® RCOH + NADPН + H⁺

RCOH + NADP⁺ + H₂O ® RCOOH + NADPН + H⁺

На рис. 4.31 изображен активный центр алкогольдегидрогеназы из печени лошади. Кофермент NAD⁺ фиксируется в активном центре фермента водородными связями с несколькими аминокислотными остатками: Ser48, His51, Ile269, Val292, Ala317, Phe319. Ион цинка

Рис. 4.31. Дегидрогенирование бензилового спирта, катализируемое алкогольдегидрогеназой из печени лошади. Для протекания реакции необходимо присутствие кофермента NAD⁺, удерживаемого в активном центре фермента с помощью водородных связей с аминокислотными остатками Ser48, His51, Ile269, Val292, Ala317, Phe319. Ион Zn²⁺фиксирован в активном центре фермента путем координации с тремя аминокислотными остатками: Cys46, His67, Cys174, четвертая координационная связь направлена на спиртовую группу субстрата, подвергающуюся дегидрированию. Zn²⁺ способствует поляризации спиртовой группы и облегчает отрыв гидрид-иона коферментом (согласно [29])

стабилизирован образованием трех координационных связей с Cys46, His67, Cys174, четвертая координационная связь образуется с кислородом спиртовой группы субстрата, что приводит к поляризации гидроксильной группы и облегчает отрыв гидрид-иона коферментом.

К пероксидазам (К.Ф. 1.11.1), играющим существенную роль в метаболизме ксенобиотиков, относят следующие ферменты человека: пероксидазу эозинофилов, миелопероксидазу, лактопероксидазу, тироидпероксидазу.

Рис. 4.32. Механизм действия пероксидаз (буквой Р обозначен протопорфирин IX). Донором кислорода является или перекись водорода, или органическая перекись ROOH, гетеролитическое расщепление которой дает воду или спирт и оксигенированное производное фермента, обозначаемое как соединение I. Соединение I может непосредственно переносить кислород на молекулу-акцептор, в данном случае сульфид, с образованием сульфоксида (реакция г), чаще наблюдается одноэлектронное окисление субстрата, например фенола, с образованием феноксильного радикала (реак-ция б), соединение I при этом восстанавливается в соединение II, которое способно окислить еще одну молекулу субстрата до феноксильного радикала, а само перейти в исходную форму пероксидазы (реакция в), образующиеся радикальные промежуточные продукты могут использоваться организмом для борьбы с патогенами (согласно [29])

Эти ферменты, как и цитохром Р450, являются гемопротеинами, содержащими в качестве простетической группы протопорфирин IX. На рис. 4.32 представлен механизм действия пероксидаз. После связывания субстрата (перекиси водорода или органической перекиси R-OOH) донор кислорода гетеролитически распадается с образованием воды или R-OH и оксигенированной формы фермента, получившей название соединение I (compound I) (см. рис. 4.32, а). Соедине- ние I подвергается двухэлектронному окислению, при этом протопорфирин IX, как видно из рис. 4.32, отдает один электрон. Наблюдается сходство между состоянием окисления-оксигенации пероксидазы и состоянием [FeO]³⁺ цитохрома Р450. Соединение I может непосредственно переносить атом кислорода на другие ксенобиотики, например сульфиды (см. рис. 4.32, d), но чаще происходит одноэлектронное окисление субстрата, способного к восстановлению (на рис. 4.32 это фенол, образующий при окислении соединением I феноксильный радикал), само же соединение I восстанавливается в результате одноэлектронного переноса в соединение II. Соединение II способно окислить следующую молекулу субстрата или радикал, образовавшийся на предыдущей стадии реакции, также в результате одноэлектронного переноса. После выделения молекулы воды соединение II переходит в исходную форму пероксидазы. Феноксильные радикалы могут димеризоваться или присоединять молекулу кислорода с образованием пероксильных радикалов (схе- ма 10).

(10)

Радикальные промежуточные продукты, образующиеся в результате действия пероксидазы, способны инициировать окислительный стресс и связываться ковалентно с биополимерами, например нуклеиновыми кислотами, что используется организмом в борьбе с патогенами.

Моноаминооксидаза (МАО, К,Ф, 1.4.3.4) содержит FAD в качестве простетической группы. Фермент локализован во внешней мембране митохондрий, хотя следовые количества обнаруживаются и в других компартментах.

Реакция, катализируемая МАО, состоит из двух полуреакций: в первой происходит окислительное дезаминирование под действием окисленной формы FAD, во второй полуреакции восстановленный FADН₂ окисляется молекулой кислорода с регенерацией окисленной формы FAD и образованием перекиси водорода, что отличает эту реакцию от реакции окислительного дезаминирования, катализируемой цитохромом Р450, где одним из продуктов является вода.

FAD + R-CH₂-NH₂ + H₂O → FADH₂ + R-CHO + NH₃

первая полуреакция - окислительное дезаминирование

FADH₂ + O₂ → FAD + H₂O₂

вторая полуреакция - регенерация кофермента

На рис. 4.33 представлен каталитический цикл моноаминооксидазы. Окисление восстановленного FADН₂ с помощью МАО проходит в три этапа. Сначала происходит одноэлектронное окисление до состояния FADН₂^•+с одновременным образованием супероксидного аниона (рис. 4.33, f), далее образуется гидропероксид флавина FADН-ООН (стадия g на рис. 4.33), который распадается с выделением перекиси водорода и окисленной формы флавина - FAD.

Рис. 4.33. Механизм каталитического действия моноаминооксидазы. Реакция начинается а - со связывания субстрата в активном центре фермента, b - с последующим одноэлектронным окислением аминогруппы субстрата и восстановлением простетической группы до состояния FAD^•-, с - на следующей стадии происходит отрыв атома Н от субстрата и перенос его на простетическую группу, d - в результате второго одноэлектронного этапа окисления и отрыва атома водорода образуется имин и восстановленный FADН₂, е - гидролиз имина приводит к высвобождению аммиака и образованию альдегида, f-h - для окончания каталитического цикла МАО связывает молекулу кислорода, окисляющую восстановленный FADН₂, при этом образуется перекись водорода (согласно [29])

Физиологическими субстратами МАО являются в основном первичные амины: дофамин, норадреналин, серотонин, триптамин. Фермент представляет интерес для исследования, так как известно, что он метаболизирует 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин с образованием нейротоксина, вызывающего у человека развитие болезни Паркинсона.

Ксантиноксидаза (ХО, К.Ф. 1.17.1.4), относящаяся к семейству молибденовых гидроксилаз, представляет собой гомодимер. В N-концевой части субъединиц располагаются два Fe₂-S₂ восстановительных кластера, FAD-связывающий домен, а в С-концевой части молекулы - субстрат-связывающий центр. Здесь же связывается молибдоптериновая простетическая группа.

Рис. 4.34. Окисление ксантина до мочевой кислоты, катализируемое ксантиноксидазой, коферментом которой выступает молибдоптериновая группа. Электроны с восстановленного кофермента могут передаваться на FAD и далее в условиях низкого парциального давления кислорода на нитрогруппу ксенобиотика, восстанавливая ее в нитрозосоединение, или через железо-серные кластеры на цитохром с. В условиях насыщения кислородом происходит образование гидроксипероксидного радикала или перекиси водорода (согласно [29])

ХО катализирует двуэлектронное окисление атома кислорода воды и внедрение этого реакционноспособного атома кислорода в субстрат, в качестве акцептора электронов выступает молекулярный кислород: из одной молекулы кислорода образуется одна молекула перекиси водорода, в присутствии двух молекул кислорода - два гидропероксидных радикала (рис. 4.34, а). Электроны в условиях низкого парциального давления кислорода могут акцептироваться ксенобиотиком, содержащим восстанавливаемую группу (например, нитросоединение может восстанавливаться под действием ХО до нитрозопродукта (рис. 4.34, b)).

К реакциям первой фазы биотрансформации ксенобиотиков относятся также реакции гидролиза, а именно эстеразные реакции. Это гидролиз неспецифическими эстеразами сложных эфиров, амидов, гидразидов, эпоксидов и т. д.

Так эпоксиды (например, моноэпоксиды бензола, полициклических ароматических углеводородов) превращаются под действием эпоксидгидролаз в трансдигидродиолы.

Для осуществления этого превращения не требуется присутствие в среде кофакторов. Образующиеся дигидродиолы являются субстратами цитохрома Р450, который переводит их в диэпоксиды, выступающие более активными канцерогенами, чем исходные моноэпоксиды.

К недостаткам ферментных систем первой фаза биотрансформации ксенобиотиков следует отнести: 1) слабость или отсутствие во многих жизненно важных органах (сердце, головной мозг); 2) меньшая защита при других путях попадания в организм (слизистые, раны, инъекции); 3) токсификация некоторых веществ.

Как мы рассмотрели выше (например, превращения бенз(а)пи-рена в бенз(а)пирендиолэпоксид или хлороформа в фосген), в результате первой фазы биотрансформации ксенобиотиков могут образоваться продукты с большей токсичностью по сравнению с исходным веществом. Это может объясняться внедрением в молекулу полярной группы, что увеличивает реакционноспособность вещества по отношению к другим соединениям.

4.3.2.3. Вторая фаза биотрансформации ксенобиотиков. Превращение молекул в первой фазе биотрансформации усиливает их полярность и уменьшает способность растворяться в липидах. Благодаря этому целый ряд чужеродных соединений лучше выделяется с мочой. Во второй фазе биотрансформации ксенобиотиков продолжается увеличение гидрофильности и снижение токсичности чужеродных соединений за счет конъюгации промежуточных продуктов метаболизма с эндогенными молекулами, такими как глутатион, глицин, глюкуроновая кислота, метильные, ацетильные или сульфогруппы и т. д.

Ферменты, катализирующие эти реакции, обнаружены во всех организмах. Как и ферменты первой фазы метаболизма ксенобиотиков, ферменты, участвующие во второй фазе, обладают слабой субстратной специфичностью и катализируют превращения большой группы химических веществ. Главными среди них выступают трансферазы.

Ферменты второй фазы биотрансформации ксенобиотиков можно классифицировать следующим образом:

1) ферменты, формирующие эфирные или амидные связи с промежуточными метаболитами по функциональным группам ксенобиотика (ОН, СООН, NH₂, SH): ацетил КоА: амин N -ацетилтрансфе-раза; сульфотрансфераза; UDP-глюкуронозилтрансфераза;

2) ферменты, активирующие конъюгацию веществ с глутатионом при участии активированных форм ксенобиотиков (ареноксиды; эпоксиды; галогенированные алкильные и арильные углеводороды): глутатион S -трансферазы;

3) ферменты, активирующие конъюгацию веществ с цистеином при участии активированных форм ксенобиотиков (СООН): цистеин-конъюгирующие b-лиазы.

UDP-глюкуронозилтрансфераза. Наиболее важными реакциями этой фазы в количественном отношении являются реакции конъюгации с глюкуроновой кислотой, которая активно присоединяется к молекулам алифатических и ароматических спиртов, органических кислот, серосодержащих соединений. Процесс конъюгации приводит к образованию эфиров глюкуроновой кислоты - глюкуронидов. Глюкуроновую кислоту предварительно необходимо перевести в активную форму путем образования UDP-производного - уридиндифосфоглюкуроновой кислоты (УДФГК) из глюкозо-1-фосфата и UDP. На первой стадии из глюкозо-1-фосфата и UDP под действием уридилтрансферазы образуется уридиндифосфатглюкоза, которая далее окисляется NAD⁺ сначала до альдегидного производного, а потом до УДФГК:

.

UDP-глюкуронозилтрансфераза (К.Ф. 2.4.1.17) переносит остаток глюкуроновой кислоты на молекулу-акцептор: фенол, спирт, карбоновую кислоту, давая О -глюкурониды; аминогруппу, сульфамидную группу, карбамильную группу или гетероциклическое азотистое соединение, образуя N -глюкурониды; тиоловые соединения с образованием S- глюкуронидов.

Рис. 4.35. Пространственная структура асимметричного димера UDP-глюкуронозилтрансферазы человека (согласно [23])

UDP-глюкуронозилтрансфераза локализована в мембране эндоплазматического ретикулума, представляет собой асимметричный димер (рис. 4.35), в С-концевом домене которого связывается UDP-глюкуроновая кислота, а в N-концевом вариабельном домене - молекула-акцептор. В зависимости от вида молекулы-акцептора существует 14 изоформ UDP-глюкуронозилтрансферазы человека.

Механизм действия UDP-глюкуронозилтрансферазы, подобно сериновым протеазам, основан на нуклеофильном катализе с помощью триады аминокислотных остатков: серина, гистидина и аспарагиновой кислоты (рис. 4.36). Как видно из рис. 4.36, His35 депротонирует ОН-группу молекулы-акцептора, облегчая нуклеофильную атаку на С1-атом глюкуроновой кислоты. Протонированный остаток гистидина стабилизирован располагающимся рядом остатком Asp151.

Рис. 4.36. Механизм действия UDP-глюкуронозилтрансферазы человека. His35 депротонирует ОН-группу молекулы-акцептора, облегчая нуклео-фильную атаку на С1-атом глюкуроновой кислоты. Asp151 стабилизирует протонированный остаток His35 (согласно [23])

UDP-глюкуронозилтрансфераза индуцируется при поступлении в организм таких веществ, как фенобарбитал, ПАУ, диоксины, полигалогенированные бифенилы. На рис. 4.37 представлены некоторые реакции конъюгации ксенобиотиков с глюкуроновой кислотой. С помощью конъюгации с глюкуроновой кислотой метаболизируют и некоторые эндогенные вещества, например стероиды и билирубин.

Рис. 4.37. Реакции конъюгации ксенобиотиков с глюкуроновой кислотой

В кишечнике под влиянием глюкуронидазы, фермента кишечной микрофлоры, глюкурониды могут расщепляться с образованием веществ, способных к реабсорбции и обратному поступлению в кровь (явление кишечно-печеночной циркуляции ксенобиотика).

Сульфотрансфераза. Другим классом конъюгатов являются сложные эфиры ксенобиотика с серной кислотой или эфирсульфаты: арилсульфаты (сложные эфиры фенольных соединений), алкилсульфаты (сложные эфиры первичных алифатических спиртов), сульфаматы (сложные эфиры серной кислоты и аминов, содержащих сульфамидную группу), стероидные сульфаты (сложные эфиры первичных спиртовых групп стероидной боковой цепи), углеводные сульфаты (сложные эфиры гидроксильных групп углеводов).

Процесс конъюгации протекает в несколько этапов. На первом этапе образуется активная форма сульфата - 3’-фосфоаденозил-5’-фосфосульфат (ФАФС).

Перенос сульфогруппы от ФАФС на молекулу-акцептор (фенол, амины, стероиды и др.) осуществляется с помощью сульфотрансферазы. В зависимости от строения молекулы-акцептора в процесс вовлекаются различные сульфотрансферазы. Ферменты, расположенные в мембранах аппарата Гольджи, переносят сульфогруппу на белки, пептиды, липиды, гликозаминогликаны. Система конъюгации с сульфатом ксенобиотиков, стероидов, желчных кислот, нейротрансмиттеров локализована в цитозольной фракции гепатоцитов. Сульфотрансферазы не индуцируются ксенобиотиками и обладают высокой субстратной специфичностью.

На рис. 4.38 представлена пространственная структура одной из цитозольных форм сульфотрансферазы человека - SULT1A1. Во всех формах фермента сайт связывания ФАФС консервативен, а место связывания молекулы-акцептора вариабельно. Белок способен метаболизировать большое количество субстратов, при этом сайт связывания молекулы-акцептора каждый раз подгоняется под субстрат.

Рис. 4.38. Пространственная структура сульфотрансферазы человека SULT1A1. Посредине изображен 3’-фосфоаденозил-5’-фосфат (розовый) (согласно [14])

Для проявления сульфотрансферазной активности важны консервативные остатки лизина (Lys48 в SULT1A1) и гистидина (His108 в SULT1A1), выступающие в роли кислоты и основания (рис. 4.39).

Рис. 4.39. Механизм сульфотрансферазной реакции (согласно [30])

Согласно рис. 4.39, аминогруппа Lys48 протонирует мостиковый атом кислорода, расположенный между фосфатной и сульфатной группами, и облегчает уход сульфогруппы. Атом азота имидазольного кольца His108 депротонирует фенольную группу эстрадиола, увеличивая ее нуклеофильность и способствуя взаимодействию с сульфогруппой.

Запасы ФАФС в печени незначительны, легко истощаются, что при высоких токсических нагрузках приводит к переключению метаболизма на другие пути, например конъюгацию с глюкуроновой кислотой. Сульфатация, таким образом, является системой с «высоким сродством, но малой мощностью», а глюкуронидирование, напротив, - с «малым сродством, но высокой мощностью».

Метилтрансфераза. В качестве конъюгирующих агентов часто идентифицируют метильные группы, которые переносятся метилтрансферазами от кофермента S- аденозилметионина на амины, фенолы, тиоловые соединения с образованием N -, O -, S -метиловых конъюгатов.

ROH + SAM ® ROCH₃

Среди эндогенных веществ при участии фермента катехол- О -метилтрансферазы (КОМТ) таким образом метаболизируют адреналин, норадреналин, дофамин. При этом образуются малоактивные 3-метоксипроизводные катехоламинов, которые выводятся из организма.

Ацилтрансфераза. Основным путем метаболизма ароматических и алифатических аминов, сульфамидов, гидразидов и некоторых чужеродных ароматических аминокислот является реакция ацетилирования по аминогруппе, имеющая место в печени. Уксусная кислота переносится на аминогруппу в форме ацетилКоА с помощью ацетилтрансферазы.

RNH₂ + CH₃COSCoA ® RNHCOCH₃ + CoASH

Не только уксусная кислота, но и другие органические кислоты способны превращаться в организме в активную форму, вступая во взаимодействие сначала с АТР, а потом с CоА (жирные кислоты, карболовая кислота, бензойная кислота, фенилуксусная кислота и др.). В форме RCOSCoA вещества взаимодействуют с соединениями, содержащими аминогруппу (глицином, глутаматом), с образованием конъюгатов. Так, бензойная кислота, активированная CоА, конъюгирует с глицином с образованием гиппуровой кислоты, выделяющейся с мочой. Активированная форма фенилуксусной кислоты в организме человека связывается с глутаматом.

Глутатионтрансфераза (К. Ф. 2.5.1.18). Метаболизм большого количества ксенобиотиков обеспечивает также семейство глутатионтрансфераз, активность которых зависит от поступления ксенобиотика в организм.

Эти ферменты находятся в основном в цитоплазме, но обнаруживаются также в мембранах эндоплазматического ретикулума и митохондрий, а также в хроматине. Глутатионтрансферазы катализируют реакцию конъюгации ксенобиотика с глутатионом (GSH), протекающую в нескольких вариантах:

1) присоединение к ксенобиотику полной молекулы глутатиона

R + GSH ® HRSG;

2) нуклеофильное замещение по электрофильным атомам С (нитроалканы), N (тринитроглицерин), S (тиоцианаты) и P (метилпаратион) RХ + GSH ® RSG + НХ;

3) восстановление органических гидроперекисей до спиртов RCHOOH + 2 GSH ® RCHOH + GSSG + H₂O, где GSSG - окисленный глутатион, с последующей конъюгацией спиртовой группы со второй молекулой GSH.

В дальнейшем глутатионовые конъюгаты подвергаются отщеплению сначала остатка глутаминовой кислоты с помощью глутамилтранспептидазы, а потом остатка глицина действием цистеинглициназы. В результате последующего ацетилирования с помощью ацетилСоА по аминогруппе из организма выделяются метаболиты в форме, связанной с N -ацетилцистеином (меркаптуровые кислоты) (рис. 4.40).

Рис. 4.40. Взаимодействие ксенобиотика с глутатионом и последующие превращения комплекса

В ходе превращения под действием ГСТ некоторых ксенобиотиков образуются тиоэфирные конъюгаты, далее метаболизирующиеся в меркаптаны, среди которых много токсических веществ. Большинство образующихся конъюгатов GSH с ксенобиотиками менее реакционноспособны, более гидрофильны, чем исходные соединения, и легко выводятся из организма. ГСТ может связывать своими гидрофобными сайтами также липофильные соединения, тем самым защищая от внедрения и разрушения липидный слой мембран, а значит, и всю клетку от нарушения функционирования. Поэтому ГСТ получили наименование внутриклеточных альбуминов.

Рис. 4.41. Пространственная структура мономеров глутатион- S -трансфе- раз классов альфа, мю, пи человека и возбудителя малярии у человека Pla- smodium falciparum (PfGST). Показаны места связывания глутатиона (G-сайт) и ксенобиотика (Н-сайт) (согласно [13])

Мембрансвязанные глутатионтрансферазы (лейкотриенсинтаза и микросомальная глутатионотрансфераза II) участвуют в изомеризации некоторых стероидов и простагландинов. Эти ферменты отличаются от цитозольных глутатионтрансфераз своими свойствами и пространственным строением. Их участие в метаболизме ксенобиотиков не обнаружено.

Цитозольные глутатион- S -трансферазы (ГСТ) представляют собой димерные белки, которые на основе аминокислотных последовательностей, иммунологических свойств и специфичности взаимодействия с субстратом разделены, по крайней мере, на 13 эволюционно различных классов: митохондриальная ГСТ каппа (К), ГСТ человека: альфа (А), мю (М), пи (Р); ГСТ насекомых: тета (T), сигма (S), зета (Z), омега (О); ГСТ растений: фи (F) и тау (U); ГСТ бактерий: дельта (D), бета (В) и ипсилон (Е). Фи и тау ГСТ обнаружены пока только в растениях и участвуют в детоксификации гербицидов.

Митохондриальная каппа ГСТ, которую рассматривали на основании анализа генов, кодирующих разные изоформы данного белка, в качестве предшественницы всех остальных цитозольных глутатионтрансфераз, по своему строению и механизму действия подобна дисульфидизомеразе.

Несмотря на низкую гомологию аминокислотных последовательностей, глутатионтрансферазы обладают сходной трехмерной структурой. Каждый мономер в димере содержит N-концевой тиоредоксин-подобный a/b домен со структурой bababba и С-концевой a-спиральный домен. Активный центр располагается в щели между двумя доменами и состоит из двух сайтов: G и Н. Консервативный G-сайт предназначен для связывания молекулы GSH, а молекула ксенобиотика фиксируется в вариабельном Н-сайте. На рис. 4.41 изображены пространственные структуры мономерных форм некоторых глутатионтрансфераз, стрелками указано положение G- и Н-сайтов.

Механизм действия фермента заключается в нуклеофильной атаке тиолатным анионом глутатиона неполярной молекулы ксенобиотика, содержащей электрофильный атом углерода, азота или серы. Для образования тиолатного аниона протон с сульфгидрильной группы GSH оттягивает на себя или остаток серина (Ser9 в ГСТ тета, Ser16 в ГСТ каппа), или остаток тирозина (Tyr8 в ГСТ альфа, Tyr6 в ГСТ мю, Tyr7 в ГСТ пи и ГСТ сигма), или остаток цистеина (Cys32 в ГСТ омега).

Аналогичным образом происходит взаимодействие ксенобиотиков с цистеином и ацетилцистеином.

Ферменты второй фазы биотрансформации ксенобиотиков превращают только вещества, имеющие функциональные группы, − в этом заключается ограничение их функционирования. К достоинствам этих ферментов следует отнести: 1) наличие во всех клетках организма; 2) функционирование при любых путях поступления ксенобиотиков в организм; 3) осуществление или завершение детоксикации и исправление ошибок первой фазы. Они превращают токсичные метаболиты ПАУ (канцерогены), хлороформа (фосген), парацетамола.

Для метаболизма некоторых ксенобиотиков достаточно реакций только первой или второй фазы биотрансформации. Но большинство чужеродных соединений подвергаются превращениям первой фазы с последующей конъюгацией во второй. При этом совместное функционирование обеих фаз обеспечивает эффективное обезвреживание тысяч ксенобиотиков всех возможных классов химических соединений: токсинов, мутагенов, канцерогенов, пестицидов, инсектицидов, красителей, растворителей, лекарств. Все это позволяет увеличить устойчивость клеток и организма и выжить в условиях загрязненной среды.

4.3.2.4. Третья фаза биотрансформации ксенобиотиков. Основное назначение этой фазы заключается в выведении гидрофильного конъюгированного ксенобиотика из клетки, а потом и из организма.

В плазме крови ксенобиотики переносятся альбумином, липопротеинами и кислым a₁-гликопротеином. Последний, являясь индуцируемым белком, обнаруживается в организме в ответ на реакции, возникающие в условиях стресса: инфаркте миокарда, воспалительных процессах. Ксенобиотики, связавшись с кислым a₁-гликопро- теином, переносятся в печень, где подвергаются метаболизму и далее выводятся из организма.

Существуют различные механизмы вывода конъюгатов из клетки и организма. Они включают в себя АТР-зависимый GS-Х ионный насос, широкоспецифичный транспортер органических анионов (multispecific organic anion transporter - MOAT), широкоспецифичный анионный транспортер динитрофенольных конъюгатов GSH (Dnp-SG ATPase), Р-гликопротеин (белок-ионный насос, ответственный за множественную лекарственную устойчивость) и белки, вызывающие множественную лекарственную устойчивость (multidrug-resistance-associated protein - MRP).

Широкоспецифичный анионный транспортер динитрофенольных конъюгатов GSH (Dnp-SG ATPase) представляет собой белок молекулярной массой 38 kDa, экспрессирующийся во многих тканях организма: легких, мышцах, печени, поджелудочной железе, но особенно он важен для выведения токсичных соединений из эритроцитов, где набор белков-транспортеров конъюгатов ксенобиотиков ограничен.

4.3.2.5. АВС-транспортеры (ABC - ATP-binding cassette, АТР-связывающая кассета). Огромное значение в процессе транспорта чужеродных соединений через клеточную мембрану имеет суперсемейство транспортных белков, известное как ATP-binding cassette (ABC).

АВС-транспортеры - это мембранные белки, использующие энергию гидролиза АТР для переноса через клеточную мембрану различных веществ: от неорганических ионов до полисахаридов и белков.

Известно, что некоторые из АВС-транспортеров (multidrug-resistance-associated protein - MRP и Р-гликопротеин) ответственны за вывод из организма лекарственных препаратов и за развитие устойчивости опухолевых клеток к действию цитостатиков, так называемой множественной лекарственной устойчивости, МЛУ опухолевых клеток (multidrug resistance, MDR), которая сопровождается рецидивами болезни и метастазами. Исследование АВС-транспор- теров, таким образом, важно для практической онкологии, так как с ними связаны неудачи лечения злокачественных новообразований.

Рис. 4.42. Вторичная структура короткого и длинного белков-транспортеров семейства ABC (ATP-binding cassette). MSD (membrane-spanning domain) - мембранпронизывающий домен (для короткого АВС транспортера, представленного белками MRP4, 5, 8, 9, - два, для длинного, представленного белками MRP1, 2, 3, 6, 7, - три). NBD (nucleotide-binding domain) - нуклеотидсвязывающий домен, содержащий последовательности: Walker A, Walker B, мотив С - LSGGQ (мотив семейства АВС) (согласно [10])

На сегодняшний день у человека открыто 49 АВС-транспортеров. Эти белки разделены на 7 семейств, обозначаемых буквами от А до G. Белки, вызывающие множественную лекарственную устойчивость (MRP), относятся к семейству С (АВСС), а Р-гликопротеин - к семейству В (АВСВ). В отличие от Р-гликопротеина для функционирования MRP необходим GSH. Это указывает на то, что MRP является одним из транспортеров конъюгатов глутатиона.

Белок-транспортер семейства АВС содержит обычно два (для так называемого короткого транспортера, для длинного - три) мембранпронизывающих домена (membrane-spanning domains - MSDs), каждый из которых состоит из шести трансмембранных спиральных участков (transmembrane (TMDs) a-helices) и двух цитозольных нуклеотидсвязывающих доменов (nucleotide-binding domains - NBDs), как это представлено на рис. 4.42.

Высококонсервативный нуклеотидсвязывающий домен (NBD) содержит три консервативных последовательности, обозначаемые как Walker A (WA), Walker B (WB) мотивы, обнаруженные во многих АТРазах, и последовательность LSGGQ (или С мотив), найденную только в АВС белках. Для проявления активности транспортера необходимо кооперативное связывание двух молекул АТР с активными центрами, образованными последовательностями WA и WВ одного NBD и последовательностью С другого NBD. При этом связывание АТР с NBD1 и NBD2 неэквивалентно: NBD1 обладает большим сродством к АТР, чем NBD2, но NBD2 имеет большую АТРазную активность, чем NBD1. Пространственное расположение TMD и NBD в одном из представителей белков-транспортеров семейства АВСС - МRP1 изображено на рис. 4.43.

Из рисунка видно, что при функционировании белка-транспортера происходит сближение второго и третьего MSDs и обоих NBDs. В результате сближения происходит формирование активных центров, связывающих и гидролизующих АТР, и центров, непосредственно переносящих через мембрану клетки конъюгаты ксенобиотиков, таких как конъюгаты афлатоксина B1, 4-нитрохи- нолин-1-оксида, гербицидов и пестицидов или конъюгаты эндогенных веществ (конъюгаты цистеиниллейкотриена С4, простагландина A2).

Механизм передачи взаимодействия от NBDs к TMDs в деталях не выяснен. Известно, что в отсутствие АТР, NBDs открыты, а TMDs закрыты снаружи и открыты в сторону цитоплазмы. После взаимодействия NBDs с АТР и образования димера TMDs, cвязав переносимое вещество и изменив свою конформацию, закрываются со стороны цитоплазмы и открываются наружу, выбрасывая в межклеточное пространство переносимое через мембрану клетки соединение. После гидролиза АТР конформация TMDs возвращается к первоначальной (рис. 4.44).

Рис. 4.43. Пространственное расположение трансмембранных спиральных участков MSD белка-транспортера семейства АВСС - МRP1 (multidrug-resistance-associated protein). Видно, что сближены второй и третий MSD, а также оба NBD. Расположение первого MSD показано, но точное его расположение относительно остальной части молекулы транспортера неизвестно, так как пока нет структурных данных о длинном белке-транспортере (согласно [9])

Способность АВС-транспортеров, в том числе MRP и Р-глико-протеина, выводить из клетки соединения разной химической природы до последнего времени оставалась загадочной. Субстратами этих белков-транспортеров выступали липофильные соединения, имеющие небольшие размеры и содержащие в структуре ароматические кольца или несущие положительный заряд. Кристаллографическими исследованиями было показано, что для связывания переносимых веществ необходимо расплетание лигандсвязывающего a-спирального домена в составе TMDs АВС-транспортера и образование внутреннего кармана с отрицательно заряженным остатком глутаминовой кислоты, с высоким сродством связывающим положительно заряженные лиганды. По-видимому, в нормальных клетках функция этих белков заключается в выводе вредных для клеток метаболитов, гормонов и создания барьера, защищающего от вредных воздействий мозг. Лекарственные препараты воспринимаются этими белками как вредные соединения, которые необходимо выбросить из клетки.

Рис. 4.44. Гипотетическая модель функционирования АВС-транспорте-ра на примере MRP1 (multidrug-resistance-associated protein). MSD1-NBD1 и MSD2-NBD2 изображены слева и справа соответственно. В качестве субстрата показан лейкотриен С₄ (LTC₄). 1 − MRP1 закрыт снаружи и связывает LTC₄ со стороны цитоплазмы; 2 и 3 − взаимодействие двух молекул АТР с димером NBDs приводит к закрытию переносчика со стороны цитоплазмы, открытию наружу и выходу LTC₄ в межклеточное пространство; 4 − гидролиз первой молекулы АТР в NBD2 и выброс ортофосфата, а потом ADP внутрь клетки с последующим гидролизом второй молекулы АТР в NBD1 (6) заканчиваются изменением конформации белка-транспортера, возвращающегося к первоначальному виду (1) (согласно [10])

Для снижения устойчивости клетки к действию цитостатических лекарственных средств необходим поиск ингибиторов Р-гликопро- теина и MRP.

Поиск по сайту: