Преимущества РЦР перед другими методами

Для выявления уникальной нуклеотидной последовательности методом ПЦР достаточно 10 копий матрицы. К преимуществам полимеразной реакции нужно отнести следующее:

1. Метод прямой и позволяет достичь предельно возможной чувствительности (от нескольких копий до одного возбудителя в пробе).

2. Специфичность метода приближается к 100%.

3. Для ПЦР-анализа пригоден любой материал, в том числе и гистологические препараты.

4. Метод позволяет определять число копий возбудителя в пробе и тем самым наблюдать динамику.

5. Исследуемый материал может быть дезинфицирован химической или термической обработкой в момент его забора, и, следовательно, исключается возможность инфицирования персонала в процессе проведения ПЦР.

6. Метод прост в исполнении, возможна его полная автоматизация.

7. Результаты получают через несколько часов, т.е. в течение одного рабочего дня.

Рис. 6.7. Сопоставление результатов ПЦР-РВ с калибровочной прямой: наблюдается рост количества ПЦР-продукта в каждой пробирке (а), определяется по имеющейся калибровке точное исходное количество образца в пробе (б)

Области применения:

1. Метод ПЦР применяется для выявления в клинических образцах:

Вирусов

Микобактерий

Простейших

Бактерий

для обнаружения врожденных и приобретенных генетических нарушений

для идентификации личности.

Сфера применения ПЦР в диагностике будет постепенно расширяться, поскольку в клинической практике все чаще имеют дело с очень небольшими по размеру биоптатами, получаемыми, например, при эндоскопических исследованиях; или это тонкоигольные аспираты и т.д. В подобных случаях обычный гистологический анализ затруднен. Перечислим, для чего может служить ПЦР.

2. В иммунологических исследованиях ПЦР чаще всего используется:

• для определения полиморфизма генов, белковые продукты которых участвуют в иммунологических реакциях;

• для определения экспрессии цитокинов, рецепторов цитокинов и других эффекторных молекул;

• для ДНК типирования HLA аллелей и др.

ДНК, выделенную из лимфоцитов, анализируют следующими вариантами ПЦР.

1. ПЦР-праймер со специфической последовательностью (PCRSSP).

2. ПЦР-олигонуклеотидные пробы со специфической последовательностью (PCR-SSOP).

3. ПЦР-рестрикционный анализ продуктов амплификации (PCRRFLP).

4. ПЦР-метод обратной гибридизации амплифицированного фрагмента с олигонуклеотидными зондами, фиксированными на мембране или другой твердой подложке (пластине).

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕТОДОМ МИКРОЧИПОВ

Биологические микрочипы - один из новейших инструментов биологии и медицины.

Прообразом современных микрочипов стал саузерн-блоттинг, изготовленный в 1975 г. Эдом Саузерном. Он использовал меченую нуклеиновую кислоту для определения специфической последовательности среди фрагментов ДНК, зафиксированных на твердой подложке.

Точнее всего биочипы описывает английское название «DNAmicroarrays», что означает «организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе-платформе». В качестве платформы используют пластинку из стекла, иногда и другие материалы, например кремний, различные гели. На платформу наносятся биологические макромолекулы (ДНК, белки, ферменты), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе.

В зависимости от того, какие макромолекулы используются и каковы цели исследования, выделяют различные виды биочипов:

ДНК-микрочипы

белковые микрочипы.

Методика с применением ДНК-микрочипов.

Размещенные на платформе макромолекулы занимают очень небольшой участок - размером с покровное стекло (рис. 6.8, см. также цв. вклейку). Микроскопический размер биочипа позволяет размещать на небольшой площади огромное количество разных молекул ДНК и считывать с этой площади информацию с помощью специального лазерного устройства.

Рис. 6.8. Стекла, используемые для приготовления микрочипов

В поверхностных матричных биочипах ДНК иммобилизуется на поверхности мембран или пластинок из стекла, пластика, полупроводника или металла. В гелевых биочипах ДНК иммобилизуется в слое полиакриламидного геля толщиной 10-20 мкм, нанесенного на специально обработанную поверхность стекла. Иммобилизуемая ДНК наносится на поверхность или через игольчатые растры механического робота, или с помощью технологии струйного принтера (рис. 6.9, см. также цв. вклейку). Контроль качества нанесения осуществляется с помощью специализированной оптики и компьютерного анализа изображения. Затем на биочипе гибридизуют молекулы ДНК, меченные с помощью флюоресцентной или радиоактивной метки (рис. 6.10, см. также цв. вклейку). Интенсивность флюоресценции в ячейках измеряют с помощью сканера, передающего сигнал на прибор с зарядовой связью (рис. 6.9, см. также цв. вклейку). Данные о гибридизации получают также с помощью масс-спектрометрии, атомной силовой микроскопии и др. В основе принципа работы всех типов биочипов с иммобилизованной ДНК лежит точное соответствие между комплементарными ДНК (по правилу Уотсона-Крика): А-Т, G-С. Если соответствие между нуклеотидами иммобилизованной и гибридизуемой ДНК полностью отвечает условиям комплементарности, то образующиеся дуплексы будут термодинамически наиболее устойчивы и станут давать более сильный сигнал флюоресценции. Выявление и сопоставление наиболее ярко светящихся ячеек проводит прибор - анализатор биочипов.

Рис. 6.9. Оборудование для приготовления микрочипов: механический робот для нанесения через игольчатые растры проб на поверхность стекол (а); сканер для детекции интенсивности флюоресценции в ячейках (б); данные со сканера передаются на персональный компьютер для дальнейшей обработки

Гибридизуемая ДНК обычно заранее вырабатывается в достаточных количествах с помощью ПЦР. При использовании более современных технологий ПЦР осуществляется непосредственно на чипе. Анализ на 1 микрочипе занимает 6-10 ч и позволяет провести диагностику индивидуально.

Рис. 6.10. Схема гибридизации меченой пробы с микрочипом: а - исходная поверхность микрочипа; б - добавление меченой пробы; в - гибридизация микрочипа с пробой в течение 16 ч; г - отмывка микрочипа от несвязавшейся пробы; д - детекция результатов

С помощью микрочипов возможны:

• одновременный анализ работы десятков тысяч генов, сравнение их экспрессии;

• быстрое определение наличия вирусных и бактериальных возбудителей;

• диагностика лейкозов и других вирусных заболеваний;

• диагностика различных видов раковых опухолей;

• скрининг действия новых лекарств на различные гены (такие исследования помогают создавать новые лекарственные препараты, выяснять, на какие гены и каким образом эти препараты действуют).

Еше биочипы - незаменимый инструмент для биологических исследований: в процессе одного эксперимента нередко выясняется влияние различных факторов на работу десятков тысяч генов.

Поиск по сайту: