Цитохимические исследования при лейкозах

Лекция.

(Ст. Преподаватель Свирина В.И.)

В дифференциальной диагностике гемобластозов цитохимические исследования занимают важное место. Помимо глубокого теоретического значения, неоспорима их роль в уточнении различных форм лейкозов. Разработка эффективных методов дифференцированной терапии острых лейкозов, особенно острого лимфобластного лейкоза детей, стала возможной только после применения в клинической практике цитохимических методов диагностики.

Ниже представлено краткое описание некоторых цитохимических методик. Они ограничены исследованиями, используемыми для идентификации различных форм острых лейкозов. К ним относятся реакции: на миелопероксидазу, полисахариды, хлорацетатэстеразу, альфа-ацетатнафтилэстеразу, кислую фосфатазу, липиды и кислые сульфатированные мукополисахариды.

Реакция на пероксидазу. Пероксидаза является ферментом, разрушающим перекись водорода, образующуюся в клетке в процессе жизнедеятельности. Токсичная для клеток перекись водорода обезвреживается, освобождающийся при участии пероксидазы кислород вновь используется клеткой.

Пероксидаза обнаруживается не во всех клетках, этот фермент отсутствует в лимфоидных клетках и постоянен для всех элементов миелоидного ряда. Ввиду его специфичности для нейтрофилов с ранних фаз созревания фермент получил обозначение миелопероксидазы. Уровень активности пероксидазы подвержен большим колебаниям.

Рис. 1. Положительная реакция на миелопероксидазу в клетках миелоидного ряда.

Х о д р е а к ц и и. Фиксированные мазки крови или костного мозга заливают бесцветным раствором бензидина или ортотолидина.

К раствору, перед тем как его наливают на мазок, добавляют каплю 3% перекиси водорода. Если в клетке содержится пероксидаза, то перекись водорода превращается в воду с выделением кислорода. Высвободившийся кислород окисляет бензидин или ортотолидин и переводит их в окрашенное соединение. При использовании бензидина цитоплазма клеток, содержащих пероксидазу, окрашивается в желтый цвет.

Все клеточные элементы нейтрофильного ряда костного мозга, начиная с ранних фаз созревания, дают резко положительную реакцию. В препарате цитоплазма клеток окрашена в желтый цвет.

Цитохимическая реакция на полисахариды (гликоген). Энергетические потребности клетки обеспечиваются гликогеном. Сложные метаболические процессы, связанные с расщеплением и ресинтезом гликогена под воздействием различных патологических процессов, могут извращаться. При цитохимическом анализе используется определение этих отклонений. Для обнаружения гликогена в клетках применяется ШИК – реакция.

Х о д р е а к ц и и. Под воздействием реактива Шиффа, в состав которого входит фуксин, появление в цитоплазме клеток красных или фиолетово-красных зерен указывает на присутствие полисахаридов (гликогена). После проведения ШИК – реакции и докраски гематоксилином все клеточные элементы хорошо дифференцируются. Ядра нейтрофилов окрашиваются в синий цвет, цитоплазма заполняется мелкой красной зернистостью гликогена, как бы сплошной окраской. Существует различная степень окраски цитоплазмы.

Рис. 2. Положительная реакция на гликоген в гранулоцитах (диффузное окрашивание цитоплазмы)

Моноциты содержат гликоген, выявляемый в виде мелких пылевидных красных гранул на фоне неокрашенной или розоватой цитоплазмы. В эозинофилах при ШИК – реакции неокрашивающихся из-за обилия эозинофильной зернистости, судить о содержании гликогена невозможно. Определение ШИК – реакции в эозинофилах, так же как в базофилах, практического значения не имеет. Наиболее ценно ее значение для исследования зрелых нейтрофилов и лимфоцитов.

В лимфоцитах гликоген определяется в виде сравнительно крупных красных, не сливающихся между собой, зерен. Количество их находится в зависимости от ширины пояса, образованного цитоплазмой вокруг ядра. Для уточнения характера малых лимфоцитов с тонким ободком цитоплазмы необходимо внимательное изучение препарата под микроскопом. Только наличие крупных, хотя и единичных, красных зерен указывает на положительную ШИК – реакцию лимфоцитов.

Рис. 3. Положительная реакция на гликоген в лимфоцитах (в виде гранул вокруг ядра)

Хлорацетатэстераза. Хлорацетатэстераза относится к неспецифическим эстеразам и наряду с реакцией на миелопероксидазу является биохимическим маркером клеток нейтрофильного ряда. Активность хлорацетатэстеразы, выявляемая в миелобластах, возрастает у промиелоцитов и миелоцитов. Активность фермента при остром миеломонобластном лейкозе низкая, а при остром монобластном лейкозе она совсем не обнаруживается.

Положительная реакция на хлорацетатэстеразу с использованием метода Яма позволила наряду с реакцией на миелопероксидазу дифференцировать по бластным клеткам острый миелобластный лейкоз. Положительная реакция определяется по мелкой синей зернистости, выпадающей в цитоплазме клеток.

Рис. 4. Положительная реакция на хлорацетатэстеразу в миелобастах и созревающих гранулоцитах

Альфа - ацетатнафтилэстераза (неспецифическая эстераза). Этот фермент также содержится в клетках нейтрофильного ряда, начиная с миелобласта. Реакция на альфа-ацетатнафтилэстеразу особенно ярко выражена у клеток моноцитарного ряда и их молодых форм. Она приобретает важное диагностическое значение при остром монобластном лейкозе. Характерна следующая важная отличительная особенность: при остром монобластном лейкозе неспецифическая эстераза подавляется фтористым натрием в концентрации среды 1,5 мг/мл. Этот признак позволяет отличить клетки монобластного ряда от клеток других ростков, также обладающих активностью неспецифической эстеразы. При положительной реакции на альфа - ацетатнафтилэстеразу цитоплазма клеток заполнена мелкой темно-бурой зернистостью.

Рис. 5. Положительная реакция на альфа-нафтил-ацетатэстеразу в миелобластах и созревающих гранулоцитах

Щелочная и кислая фосфатаза. Активность фосфатаз в нейтрофилах выявляется гистохимическим методом Гомори и методом азосочетания. Активность щ е л о ч н о й ф о с ф а т а з ы характерна для зрелых форм нейтрофилов, при различных заболеваниях она подвержена закономерным изменениям. В частности, для хронического миелолейкоза характерно резкое снижение щелочной фосфатазы, что является важным диагностическим признаком.

К и с л а я ф о с ф а т а з а в клетках связана с процессами клеточной дифференцировки. В клетках миелоидного ряда она выявляется уже в молодых предстадиях нейтрофилов, по мере вызревания клеток этого ряда ее активность снижается. Зрелые нейтрофилы лишены этой активности. Положительная реакция на кислую фосфатазу отмечается при остром миелобластном лейкозе. Резко положительна эта реакция при остром монобластном лейкозе.

Рис. 6. Положительная реакция на кислую фосфатазу в миелобластах и созревающих гранулоцитах

Реакция на липиды. Липиды содержатся в клетках различных тканей. Клетки костного мозга и периферической крови содержат так называемые простые липиды в виде нейтральных жиров, свободных жирных кислот и др., а также сложных липидов - фосфолипидов. Особенно много их обнаруживают в зрелых нейтрофилах. Для выявления липидов в клетках крови применяют окраску суданом черным Б. В клетках лимфатического ряда липиды не выявляются. В клетках нейтрофильного ряда липиды могут быть определены уже в бластных элементах и по мере созревания клеток этого ряда количество суданофильных веществ в гранулоцитах увеличивается. Моноциты также содержат липиды, но в меньшем количестве, чем нейтрофилы.

Рис. 7. Положительная реакция на липиды в гранулоцитах

Реакция на кислые мукополисахариды. Зернистость клеток гранулоцитарного ростка содержит кислые мукополисахариды; основным компонентом последних является хондроитин - 4 - сульфат. Наибольшее количество кислых мукополисахаридов синтезируют незрелые клетки зернистого ряда.

Реакция на сульфатированные кислые мукополисахариды специфична при промиелоцитарном остром лейкозе и характеризуется появлением в цитоплазме богатой сравнительно крупной розово-вишневой зернистости. Ядра клеток окрашиваются в светлый серо-голубой цвет.

Рис. 8. Положительная реакция на мукополисахариды в созревающих гранулоцитах

Поиск по сайту: