Метод нормировки,

2. метод внутреннего стандарта.

Метод нормировки выполняется в двух вариантах.

По первому варианту концентрация веществ находится как отношение площади пика к сумме площадей всех пиков на хроматограмме.

Сумма площадей всех пиков приравнивается к 100 % вещества.

В этом методе считается, что для всех веществ один и тот же коэффициент пропорциональности в уравнении:

C_i = K S_i

Второй вариант метода нормировки более строгий. В этом методе идет расчет по сумме площадей пиков, но с учетом коэффициентов пропорциональности.

Площадь каждого пика умножается на коэффициент пропорциональности, связанный с различной чувствительностью детектора к веществам. Заранее находят по стандартной хроматограмме К_i, приняв для одного К_i= 1.

Если есть нелетучие вещества, в этом случае метод даст завышенные результаты, т.к. часть веществ не вышла из колонки. Эти два варианта расчета применимы при работе методом теплопроводности. Для других методов они малопригодны. Дело в том, что большая часть веществ невидима детектором (нет сигнала), и в этом случае на хроматограмме остается ноль. При работе с легкокипящими веществами или для веществ, застревающих в колонке, этот метод не пригоден.

В этом случае применяется универсальный метод - метод внутреннего стандарта. Он основан на том, что готовят стандартную смесь, в которую вносят известное количество стандартного вещества и всех определяемых веществ. Выбирается стандартное вещество, имеющее время удерживания или объем удерживания отличные от этих же параметров веществ в смеси. Снимают стандартную хроматограмму и определяют коэффициенты пропорциональности определяемых веществ по отношению к стандарту. Далее в анализируемую смесь вносят известное количество стандартного вещества и снимают хроматограмму. Концентрация вещества находится по уравнению:

По предыдущим методам сумма концентраций составляла 100 %, а по последнему методу меньше – 50 или 40 %, т.е. вещества не вышедшие из колонки не исказили концентрацию.

Обычно снимают хроматограмму, смотрят по времени удерживания, какие вещества вышли. Потом подбирают стандарт, вводят его и смотрят, чтобы он попал на пустое место в хроматограмме, чтобы не было перекрывания пиков.

Мы вплотную подошли к теории газовой хроматографии, которая наиболее разработана для газожидкостного варианта. Рассмотрим следующие рисунки:

Рис. 7

а - пик размыт, б – разделен нечетко, в – четкое разделение пиков, г – пики разделены пространством чистого растворителя.

Рис. 8

Где: А - аналитический сигнал или концентрация в зависимости от температуры, времени либо от объема выходящего элюата; tr – время удерживания, Vr – объем удерживания, W- ширина основания пика

Эти величины связаны между собой через скорость газа-носителя F, выраженную в соответствующих единицах. Если объем удерживания выражен в мм, а время удерживания в минутах, то тогда скорость выражается в мм/мин. Очень важная характеристика – это ширина основания пика - ΔW. Пик может быть с широким основанием, а может быть узкий, стрелоподобный. Понятно, что такой пик лучше. А это зависит от многих факторов. Объем связан с коэффициентом распределения вещества и объемами подвижной и неподвижной фазы следующим уравнением:

Vr = D Vs + Vm,

где D ·V_s = V _c – исправленный объем удерживания;

Следующая характеристика – относительный объем удерживания. В этом случае качественной характеристикой служит не сам исправленный объем удерживания или исправленное время, а отношение времени анализируемого вещества и какого-то стандарта. Причем этот стандарт может быть специально введен в колонку, либо найден. Например, если из 100 веществ какое-то известно точно, то его и выбирают в качестве стандарта и относительно его считают исправленный объем неизвестных пиков:

где n – число теоретических тарелок,

D_в и D_а – коэффициенты распределения веществ.

Причем D_в должен быть больше, чем D_а, т.е. числитель должен быть положительным. В формуле имеется еще один член – отношение коэффициента массового распределения вещества к знаменателю 1 + Dm_в.. Если Dm_в близок к нулю, то и степень разделения в независимости от Dа будет маленькая. Главное в этом уравнении то, что при равенстве коэффициентов распределения Dв и Dа Rs = 0, т.к. числитель превращается в нуль.

Но важнейшая величина это n – число теоретических тарелок колонки. Эта величина принята в соответствии с ректификационным процессом и, примерно, пропорционально числу актов сорбция - десорбция некоторого стандартного разделяемого вещества в

хроматографической колонке. Чем больше таких актов сорбция – десорбция, тем лучше степень разделения. Число n определяется экспериментально по следующей формуле:

где Vr – исправленный объем удержания.

Число теоретических тарелок будет тем больше, чем меньше основание пика и чем больше будет Vc. Величина n определяется двумя составляющими хроматографичкеской колонки – ее длиной l и высотой, эквивалентной теоретической тарелке h:

где l – длина колонки, h – ВЭТТ высота, эквивалентная теоретической тарелке, она пропорциональна длине хроматографической колонки, на которой совершается один акт сорбция – десорбция.

Понятно, что n можно увеличивать длиной колонки, а можно снижением h. Величина h может быть рассчитана по уравнению Ван-Деемтера:

Все эти коэффициенты, в конечном итоге, описывают динамику разделяемых веществ.

Я хотел бы задать Вам один вопрос: какое минимальное значение h может быть? Минимальное значение h не может быть меньше, чем объем неподвижной фазы в какой-то части колонки, который равен пробе вещества. В идеале, если не будет размывания зоны веществ, то h может быть не меньше, чем длина колонки, в которой помещается объем газовой пробы. Вводим пробу определяемого вещества. Проба имеет какой-то объем, не нулевой, и она будет размещаться вдоль колонки. В верхней части колонки есть разделяемые вещества. Они есть и в нижней части колонки. Они заняли определенный объем, и не может быть меньше. Сконцентрировать их наша система не может, а может только разделить. А эта зона, где есть разделяемые вещества, может только размыться. Размывание этой зоны характеризуется уравнением Ван-Деемтера. Теоретически - это изображение пробы на хроматограмме. Но это в идеальном случае, который почти не достижим. Коэффициент А характеризует размывание зоны, связанное с тем, что между зернами образуются полости. В полостях возможны завихрения, т.е. поток газа не ламинарный, прямолинейный, а с завихрениями. Естественно, что молекулы, которые попали в завихрения, отстали от тех, которые проскочили. Есть другой, обратный эффект – пристеночный. Те молекулы, которые оказались возле стенки, обогнали своих соседей, и это вызывает размывание зон. Так вот, коэффициент А определяется прежде всего размерами зерен хроматографической колонки: чем они мельче, тем меньше пристеночный эффект и тем меньше эти полости, где происходит заметное отставание. Поток получается более стабильным для мелких зерен, поэтому в некоторых видах хроматографии (уравнение Ван-Деемтера относится ко всем видам хроматографии), зерна достигают диаметра одного микрона. Коэффициент В – это молекулярная осевая диффузия. Диффузия – это броунское движение, это то, что молекулы не стоят на месте, а движутся. Они не только успевают переместиться в неподвижную фазу и наоборот, но еще и движутся друг относительно друга. Причем некоторые молекулы во время движения газовой фазы движутся, обгоняя средние, а другие, отставая, и это приводит к размыванию зон. Этот эффект отражен в знаменателе. Чем больше скорость, тем эффект диффузии меньше, понятно почему, и тем меньше времени веществам необходимо, чтобы их молекулы разбежались. Теоретически представьте себе следующую ситуацию: вы ввели в хроматографическую колонку разделяемые вещества и прекратили движение газа. Что произойдет? Через некоторое время молекула распределятся все равномернее по длине колонки. Это эффект молекулярной диффузии. Чем больше скорость, тем меньше влияние этого эффекта на размывание зоны и на увеличение h.

Коэффициент С характеризует движение в неподвижной фазе. Если одна молекула зайдет внутрь неподвижной фазы глубже, а вторая не так глубоко, то, естественно, что это скажется на динамике движения молекул. Зашедшая глубже молекула отстанет, причем этот эффект будет выражен тем больше, чем больше толщина неподвижной фазы. Устраняют этот эффект тем, что неподвижную фазу наносят на поверхность очень тонким слоем – десятая доля микрона, или, как в привитых фазах, создают мономолекулярный слой. В этом случае молекулы не могут застрять надолго в неподвижной фазе. Естественно, что коэффициент С возрастает с ростом скорости подвижной фазы. Получается противоречивая картина: F и в знаменателе, и в числителе. А есть F оптимальное, которое вытекает из графического решения уравнения Ван-Деемтера. Член CF при больших скоростях определяет высоту эквивалентную теоретической тарелке. При небольших скоростях газа-носителя определяют второй член уравнения Ван-Деемтера - ВЭТТ (высоту эквивалентную теоретической тарелке).

Коэффициент В никак не снизить, он определяется температурой. Чем она выше, тем выше молекулярная диффузия. На этом графике имеется минимум, где h – минимальная. Значительный, иногда решающий вклад в величину h вносит член А – вихревая диффузия. Это уравнение отвечает на важнейшие вопрос теории хроматографии - как получить хроматографическую колонку с максимальным числом n.

График уравнения Ван-Деемтера представляет собой повернутую гиперболу. Член CF при больших скоростях определяет высоту эквивалентную теоретической тарелке. При небольших скоростях газа-носителя определяют второй член уравнения Ван-Деемтера ВЭТТ (высоту эквивалентную теоретической тарелке). На этом графике имеется минимум, которому соответствует h – минимальная. В эту величину h значительный (иногда решающий) вклад вносит член А – вихревая диффузия.

Поиск по сайту: