 |
АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция
Схема постановки основного досліду
Заняття №14
Тема: Серологічні реакції: реакція зв‘язування комплементу (РЗК), реакції з використанням мічених антитіл та антигенів – ІФА, РІФ, РІА
Актуальність теми: серологічні реакції використовуються в сучасній медичній практиці для діагностики інфекційних і інших захворювань, а також для оцінки ефективності лікування та профілактики.
Мета загальна: Знати цілі з якими проводяться серологічні реакції в медичній практиці та уміти оцінювати результати їх.
Конкретні цілі Вихідний рівень
Уміти:
| 1.Уміти поставити РЗК та оцінити її результати. | 1. Готувати різні розведення досліджуваної сироватки крові. |
| 2. Уміти оцінити результати реакцій: ІФА, РІФ, РІА | 2. Визначити титр антитіл в досліджуваній сироватці (кафедра мікробіології) |
Теоретичні питання:
1. Приципи та цілі проведення серологічних реакцій в медичній практиці.
2. Реакція зв‘язування комплементу (РЗК): цілі постановки, компоненти, механізми.
3. Компоненти для проведення РЗК: антитіла, антиген, комплемент, гемолітична система (гемолітична сироватка, еритроцити барана).
4. Реакції з використанням мічених антитіл або антигенів.
5. Реакція імунофлюоресценції (РІФ): різновиди, мета постановки, компоненти, механізм.
6. Реакція імуноферментного аналізу (ІФА): цілі постановки, компоненти, механізм.
7. Радіоімунний аналіз (РІА): мета проведення, компоненти, механізм.
При підготовці до заняття користуйтеся літературою:
1. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник/ под редакцией А.А.Воробьева.- М.: МИА, 2004. – С. 283-293.
2. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія – Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. – С. 125 – 126, 141 – 151.
3. Пояснення до самостійної роботи (додаток 1).
4. Графи логічної структури (додаток 2).
ПРАКТИЧНА РОБОТА СТУДЕНТІВ
1. Поставити основну реакцію зв‘язування комплементу (РЗК) з метою серологічної діагностики кашлюку.
2. Записати в протокол поставлену РЗК, провести облік її результату і написати висновок.
3. Вивчити і записати у протокол демонстрацію з висновками.
Алгоритм практичної роботи
Таблиця
Схема постановки основного досліду
реакції зв‘язування компелменту
| Номер пробірки | Інгридієнти | Наявність гемолізу | ||||||
| Дослідна сироватка хворого в розведенні 1/5 | Антиген (в робочій дозі) | Комплемент (в робочій дозі) | Фізіологічний розчин | Гемолітична система | ||||
| (дослідна) (контроль сироватки) 3 (контроль антигену) | 0,5 0,5 - | 0,5 - 0,5 | 0,5 0,5 0,5 | - 0,5 0,5 | Термостат: температура 370С, час 40 хвилин | 1,0 1,0 1,0 | Термостат: температура 370С, час 40 хвилин |
Робота 1.2 Основний дослід РЗК. Реакцію ставите в 3-х пробірках (табл.). Відтитровані інгридієнти (антиген, комплемент, гемолітична сироватка) розвели фізрозчином таким чином, щоб робоча доза їх містилась в 0,5 мл. Одночасно готують 3%-ну суспензію овечих еритроцитів. У підсобному ряді пробірок розвели інактивовану прогріванням (560С – 30 хвилин) досліджувану сироватку. При постановці реакції спочатку змішуєте досліджувану сироватку, антиген і комплемент. Суміш витримуйте при температурі 370С протягом 40 хвилин. Після зазначеного терміну в пробірку додайте сенсибілізовану гемолітичну систему (2 мл гемолітичної сироватки + 2 мл 3% суспензії еритроцитів). Пробірки знов стряхніть, помістіть у термостат при 370С. Реакцію визначають після того як відбудеться повний гемоліз в пробірках з контролем сироватки і контролем антигену.
Результати реакції визначають по наявності чи відсутності гемолізу у дослідній пробірці (див. табл.). Реакцію вважають позитивною при повній затримці гемолізу, коли рідина в пробірці безкольорова і еритроцити осідають на дно, негативною – при повному лізисі еритроцитів, коли рідина інфтенсивно забарвлена („лакова кров”). Ступінь затримки гемолізу оцінюють в залежності від інтенсивності забарвлення рідини і розміру осаду еритроцитів на дні (++++, +++, ++, +).
Реакція зв'язування комплементу (РЗК).
РЗК відноситься до непрямих двохсистемних реакцій, яка як і інші серологічні реакції використовуються з метою серологічної діагностики (визначення в крові специфічних комплементзв‘язуючих антитіл) з допомогою відомого антигену або визначення антигенів за допомогою відомих антитіл. Як і в інших серологічних реакціях в РЗК відбувається взаємодія антитіла і антигена, але в ній ще бере участь комплемент, який зв‘язується з антитілами (IgM, IgG), які зв‘язалися з антигеном.
Розберемо випадок, коли РЗК ставиться з метою серологічної діагностики інфекційного захворювання. До досліджуваної сироватки крові хворого додаються звісний антиген і комплемент. Якщо в цій сироватці є специфічні до даного антигену антитіла, то утворюється комплекс антиген+антитіло, який приєднує до себе комплемент. Але цей процес є непомітним візуально. Це була перша система в РЗК. Для того щоб визначити в якому стані знаходиться доданий комплемент (зв‘язаний чи не зв‘язаний), додається друга система, яка називається гемолітичною. Гемолітична система готується перед постановкою реакції і складається з гемолітичної сироватки, яка містить антитіла проти овечих еритроцитів (гемолізини) і еритроцити барана (ЕБ). Імунна реакція гемолізу в цій системі відбувається при наявності незв‘язаного в першій системі комплементу.
Досліджувана сироватка хворого перед постановкою реакції прогрівається при 560С – 30 хвилин для інактивації власного комплементу, який в ній знаходиться. В якості комплементу в РЗК використовується сироватка морської (гвінейської) свинки. Усі компоненти РЗК, за винятком досліджуваної сироватки, попередньо титруються і використовуються в робочій дозі.
В тому випадку, коли в досліджуваній сироватці є специфічні антитіла, утворюється комплекс антиген+антитіло, який через Fc-фрагмент антитіла зв‘язав комплемент, але це візуально не помітно. Тому додається до цієї суміші гемолітична система і якщо комплемент зв‘язаний в першій системі, то гемоліз в другій системі не відбувається, реакція позитивна - ЕБ знаходяться в осаді. В тому випадку, коли в досліджуваній сироватці антитіла відсутні, комплемент залишається в першій системі не зв‘язаним, вільним, і коли додається друга (гемолітична) система відбувається гемоліз еритроцитів, що свідчить про те що РЗК негативна. РЗК використовується для діагностики сифілісу, туберкульозу, бруцельозу, кандидозу, грипу і інших захворювань.
Поиск по сайту: