 |
АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция
Цитограмма 8: A
|
Читайте также: |
Создать прямоугольную область J. Она охватит все события, соответствующие жизнеспособным клеткам (негативные по 7-AAD).
3. Расстановка гейтов
Цитограмма 1
Установить гейт «J» - включение всех жизнеспособных клеток. Если 7-AAD неиспользуется, то наложите дополнительный гейт «-H» для исключения счётных частиц Stem-Count вместе с их дублетами.
Область A предусмотрена, чтобы охватывать 100 %жизнеспособных белых клеток. Счёт в ней (колонка «Count» в таблице статистик) ставится в знаменатель формулы относительной концентрации CD34+ гемопоэтических стволовых клеток.
Цитограмма 2
Установите гейт «AJ» - включение всех жизнеспособных клеток (или просто «A», если 7-AAD не используется)
Цитограмма 3
Установите гейт «ABJ» - включение всех жизнеспособных CD45+CD34+ клеток (или просто «AB», если 7-AAD не используется).
Цитограмма 4
Установите гейт «ABCJ» - включение всех жизнеспособных CD45+CD34+ клеток с низким уровнем сигнала бокового светорассеяния при исключении дебриса и тромбоцитов. Область D на этой цитограмме охватывает все истинные жизнеспособные CD34+ гемопоэтические стволовые клетки (если 7-AAD не используется, установите гейт «ABC»).
По окончании анализа для области Dв колонке «Count» таблицы статистик будет отображена абсолютная концентрация CD34+ ГСК или контрольных клеток Stem-Trol Cells.
Цитограмма 5
Эта цитограмма остаётся негейтированной для отображения всех событий.
Цитограмма 6
Установите гейт «EJ» - отображение жизнеспособных лимфоцитов, которые будут использоваться как визуальный контроль правильности установки дискриминатора (если 7-AAD не используется, установите гейт «E»).
Цитограмма 7
Установите гейт «H» - отображение счётных частиц Stem-Count Fluorospheres, включая дублеты.
Цитограмма 8
Установите гейт «A» - отображение CD45+ событий.
4. Настройка аппаратных параметров протокола
Обеспечьте правильную настройку интенсивности сигнала в каналах светорассеяния и флуоресценции в соответствии с указаниями инструкции фирмы-производителя цитометра. Отрегулируйте параметры цветовой компенсации.
Перемешайте пробы в течение 5 секунд на вортексе.
Выполните сбор данных на проточном цитометре.
Необходимо накопить не менее 75 000 событий CD45+.
Для анализа образцов: Отрегулируйте дискриминатор и положения регионов при анализе пробы в пробирке (1). Сохраните протокол и проводите анализ проб (2) и (3) без дальнейшей коррекции настроек.
5. Расчёт концентрации CD34+ ГСК в образце.
Количество CD34+ ГСК рассчитывается как среднее значение статистики «Count», выданной по области D в двух повторах проб – пробирках (1) и (2).
Результат подсчёта считается достоверным, если аналогичный результат, полученный в контрольной пробе (3) не превышает 10 % от полученного в тестовых пробах.
Усредните результат, полученный по пробам (1) и (2) для области D. Количество CD34+ ГСК в отдельно взятой пробе из дубля не должно отклоняться от среднего более, чем на 10%. Величина, полученная в контрольной пробе, должна представлять менее 10 % средней величины, полученной в дубле тестовых проб.
ЗАМЕЧАНИЯ: Если разброс в дубле составляет более 10 % от среднего значения,
проверьте, не происходит ли эта ошибка по причине неточного дозирования. Особенное
внимание следует обратить на точность дозирования образца и суспензии контрольных
частиц. Визуально оцените сходство диаграмм на распечатанных графических отчётах,
качество лизиса красной крови. Проверьте правильность установки границ областей.
При необходимости повторите сбор данных, проводя после пробы (1) и пробы (2)
промывку пробиркой с деионизованной водой или обжимающей жидкостью (BLANK). При необходимости повторите подготовку проб, включая BLANK. Проведите сбор данных в старой и новой сериях проб. Сравните результаты. При расхождениях обратитесь к представителю фирмы Beckman Coulter.
Если исследовался предварительно разведённый образец, то абсолютная концентрация клеток должна быть умножена на коэффициент разведения. Итоговый результат расчёта представляет собой абсолютную концентрацию CD34+ ГСК в клетках/мкл.
Абсолютная концентрация CD34+ ГСК = Статистика «Count» области D × Коэффициент разведении (клеток/мкл)
Для определения процентной концентрации CD34+ ГСК относительно всех CD45-позитивных клеток применяйте следующую формулу:
.
6. Распечатать результаты.
7. Заполнить протокол по определению CD 34+ ГСК и их жизнеспособности.
Поиск по сайту: