Фракціонування білків

Дуже часто задачею біохімічного дослідження є вивчення білків тканин або біологічної рідини. Рішення такої задачі доводиться починати з відділення різних білків один від одного, тобто, з їх фракціонування. У ряді випадків необхідно отримати досліджуваний білок в чистому вигляді і перевірити ступінь його чистоти за допомогою спеціальних критеріїв. Якщо вихідним матеріалом служать клітини тканин, то першим етапом роботи є розтирання або гомогенізація, за якою слідує діаліз, що видаляє присутні в середовищі малі молекули. Після цього послідовно використовують різні методи фракціонування.

Висолювання. Високі концентрації сульфату амонія і фосфатів лужних металів осаджують білки. Поступово збільшуючи концентрацію солі, можна послідовно висолити всі розчинні білки. Прийом використовують як перший ступінь фракціонування. Його ефективність невисока – майже завжди в результаті одержують ще суміш білків.

Ізоелектричне осадження. Варіюють рН середовища. Поблизу ізоелектричної точки білки мають тенденцію до випадання в осад. Таким шляхом вдається розділяти білки, які дуже відрізняються один від одного за ізоелектричною точкою.

Адсорбційна хроматографія. Деякі тверді речовини у вигляді порошків або гелів володіють здатністю зв'язувати білки слабими і малоспецифічними зв'язками. До їх числа відносяться оксид алюмінію, фосфат кальцію (гідроксил-апатит), силікагель, крохмаль.

Десорбцію білків можна проводити з використанням найрізноманітніших елюентів. Якщо елюція є виборчою, то за допомогою колектора фракцій можна збирати білки роздільно один від одного, а іноді в очищеному вигляді.

Хроматографія на іонообмінних смолах. Це один з найефективніших методів. Смоли, які зазвичай використовують для фракціонування амінокислот, тут непридатні, оскільки полімери, з яких виготовлені смоли, мають дуже часту сітку і білки не можуть проникати через її осередки. Проблема була вирішена шляхом закріплення іонізованих груп на твердому носії – целюлозі. Таким чином отримали хроматографічний метод, в якому одночасно має місце як адсорбція, так і іонний обмін. Як аніонообмінник використовують діетиламіноетилцелюлозу (ДЕАЕ-целюлозу), а як катіонообмінник – карбоксиметилцелюлозу (Км-целюлоза).

Розчинені в буфері білки подають на колонку, а потім елююють буфером у якому постійно змінюється рН (зростає або убуває). При цьому білки розділяються відповідно до їх зарядів і значення pHi. Їх збирають за допомогою колектора фракцій.

Хроматографія на декстрані (гель-фільтрація) дозволяє фракціонувати білки за молекулярною масою.

Афінна хроматографія (хроматографія за спорідненістю). Якщо білок здатний специфічно утворювати комплекси з певною речовиною, то цю речовину „пришивають” ковалентними зв'язками до інертного порошку носія і заповнюють ним хроматографічну колонку. Коли через таку колонку пропускають білкову суміш, то на ній затримується тільки здатний до утворення комплексу білок, який потім можна зняти відповідним елюентом. Таким шляхом вдається виділити певний білок з складної суміші.

Кристалізація. Іноді з її допомогою вдається отримати білок в чистому вигляді. Цим методом готують високо очищені ферментативні білки. Дуже часто кристалізацію ведуть з концентрованих сольових розчинів.

Аналіз і критерії чистоти білків. Описані нижче методи дозволяють, з одного боку, ідентифікувати різні білки, які входять до складу біологічного препарату (аналіз). З другого боку, з їх допомогою вдається показати, що в результаті виділення був отриманий дійсно індивідуальний білок (критерій чистоти). Це часто більш тонкі методи, ніж ті, які використовуються для фракціонування, і вимагають значно менших кількостей білка.

Фізичні методи. Зональний електрофорез. Методом електрофореза на ацетаті целюлози або в поліакриламідному гелі вдається розділяти дуже схожі між собою білки. Якщо білок, що вноситься, чистий, то електрофорез дає одиночну тонку смужку.

Електрофокусування. Проводять зональний електрофорез, але при цьому використовують спеціальну суміш буферів, яка забезпечує плавну зміну рН уздовж всієї довжини гелю. В кінці електрофореза кожний білок опиняється в тій зоні гелю, де рН буфера співпадає із значенням ізоелектричної точки білка рНi.

Аналітичне центрифугування. Чистий білок повинен давати при ультрацентрифугуванні один симетричний пік.

Колоночна хроматографія. Індивідуальний білок у різних хроматографічних системах повинен виходити з колонки одним симетричним піком.

Імунологічні методи. Імунологічні методи дозволяють проводити аналіз білкової суміші, дають можливість довести ідентичність двох білків різного походження або перевірити чистоту білка. Найбільш широко використовують два підходи.

Метод подвійної дифузії (Уден-Оухтерлоні). Беруть чашку Петрі і заповнюють її агаровим гелем. Вирізують в гелі два круглі отвори і заповнюють один з них досліджуваним препаратом, а інший – сироваткою тварини, імунізованої цим препаратом. Білок, що міститься в досліджуваному препараті (антиген), одночасно з антитілом дифундують в агарі. В тому місці, де вони зустрічаються, утворюється білий осад. Якщо досліджуваний препарат містить не один, а два білки, то мабуть, що вони будуть дифундувати з різною швидкістю. В цьому випадку утворюються дві роздільні смужки осадів. Таким чином можна встановити, скільки білків міститься в препараті. Ця техніка дозволяє вирішувати і важливу задачу ідентифікації білків. Нехай необхідно з'ясувати, чи є у складі складного білкового препарату певний білок А. Готують сироватку, що містить антитіла як проти досліджуваного препарату, так і проти білка А, і заповнюють нею центральний отвір агарової пластинки. Вирізують ще два отвори – в один з них поміщають комплексний антиген, а в інший – білок А. Між отвором, що містить антитіла, і отвором комплексного антигена утворюється декілька смуг. Між отворами антитіл і білка А, природно, утворюється лише одна смуга. Якщо ця остання смуга зливається своїм кінцем з однією із смуг попереднього набору так, що як би служить її продовженням, то можна стверджувати, що білок А входить до складу суміші. Якщо ж лінії не з'єднуються або перетинають одна одну, то це вказує на відсутність білка А в суміші. Таким чином, цей метод може бути використаний як критерій чистоти білка, так і ідентичності двох білків.

Імуноелектрофорез (Грабар і Вільямс). Якщо антиген є складною сумішшю білків, наприклад сироватки крові людини, то число білків, а отже, і число смуг преципітації стає настільки великим, що картина на агаровій пластинці стає нерозбірливою. Тому необхідно заздалегідь за допомогою електрофореза розфракціонувати білки на склі від мікроскопа, який покритий шаром агару, пропускаючи через нього електричний струм. Під дією струму білки, захоплюються буфером і розподіляються по довжині скла по обидві сторони від центрально розташованого отвору. Антитіла вносять в подовжню канавку. Феномен подвійної дифузії виявляється, як і в попередньому методі, даючи серію дуг, кожна з яких відповідає одному з білків, які радіально дифундують від того місця, куди він був перенесений дією струму. Цей метод чудовий не тільки для аналізу, але і як критерій чистоти препарату.

Поиск по сайту: