Световая микроскопия

Практическое занятие 2. Методы микроскопического исследования

Принцип метода. Видимая величина объекта прямо пропорциональна углу, под которым объект рассматривается. Если расстояние от глаза до объекта уменьшить вдвое, то видимые размеры объекта увеличатся вдвое. Но глаз человека не может сфокусироваться на предметах, находящихся на расстоянии меньше 25 см. Это и есть то расстояние на котором достигается максимальная разрешающая способность, видимым является объект, если его угловые размеры не менее 1`. При расстоянии в 25 см это соответствует частице величиной около 0,1 мм. Для обнаружения более мелких объектов используют микроскоп. Назначение системы линз этого прибора, расположенных между объектом и глазом, состоит в том, чтобы увеличить кажущийся угол, под которым виден объект в поле микроскопа. Помимо увеличения, большое значение имеет также контрастность и разрешение. Чтобы объект был увиден необходима определенная степень контрастности между этим объектом и окружающим фоном, а для получения четкого увеличенного изображения микроскоп должен обладать достаточной разрешающей способностью, которая позволила бы раздельно воспринимать очень близкие точки изображения.

Строение светового микроскопа. В современном микроскопе имеются три системы линз. Конденсор, расположенный между источником света и объектом, собирает лучи света в поле микроскопа. Объектив создает увеличенное изображение поля микроскопа внутри тубуса, а окуляр еще увеличивает это изображение и делает возможным воспринимать его глазом. Простым линзам присущи два оптических дефекта. Они не способны сфокусировать одновременно все поле микроскопа - сферическая аберрация и создают окрашенную кайму вокруг изображения – хроматическая аберрация. Эти дефекты сводят к минимуму используя дополнительные корригирующие линзы.

Предел разрешающей способности. Максимально полезное увеличение, достижимое с помощью светового микроскопа, определяется физическими свойствами света. Так как свет имеет волновую природу, малый объект будет виден в микроскоп как диск, окруженный рядом темных и светлых колец. Две соседние точки можно различить (разрешить), если кольца не будут перекрываться. Пределом разрешения называется наименьшее расстояние между точками, при котором их еще можно видеть раздельно. Именно этим расстоянием и определяется максимальное полезное увеличение светового микроскопа. Величину предельного разрешения (d) различить дает разрешение

d = 0,5 l /N sin a,

где l – длина волны используемого источника света, a – половина угла линзы объектива, т.е. угла между лучами, идущими от объекта к краям объектива, а N – показатель преломления среды между объектом и объективом. Знаменатель (NA) отражает свойства объектива. Если между препаратом и объективом находится воздух, то значение может достигать 0,65 и лимитируется реально возможным диаметром линзы объектива. Значение N можно увеличить, если пространство между препаратом и объективом заполнить маслом, у которого показатель преломления значительно больше, чем у воздуха. Применяя иммерсионное масло и иммерсионные линзы, можно увеличить значение NA до 1,4 (чаще до 1,25). При использовании видимого света при наилучших возможных условиях максимальное разрешение светового микроскопа приближается к 200 нм, т.е. возможно различить объект размером около 200 нм.

Поиск по сайту: