Определение энтерокиназы ( по Г.К. Шлыгину )

Энтерокиназа - специфический кишечный фермент, вырабатываемый слизистой оболочкой тонких кишок, катализирующий превращение трипсиногена в трипсин.

Принцип. В основу метода положено активирование энтерокиназой неочищенного препарата трипсиногена. Способность воздействовать на трипсиноген в его естественном виде в присутствии, ингибитора трипсина за короткое время — несколько десятков минут -является специфическим проявлением действия энтерокиназы.

.Активирование проводят в стандартных условиях с использованием ряда возрастающих разведений исследуемого материала. Находят максимальное разведение материала, которое еще обусловливает определенную интенсивность действия энтерокиназы: вызывает триптическую активность, достаточную для переваривания казеина, в отличии от его створаживания.

Реактивы. 1. Препараты трипсиногена (сухой препарат поджелудочной железы кормов, специально приготовленный для данной цели) выпускаются, Московским мясокомбинатом. Могут быть приготовлены в лаборатории. 2. Очищенный казеин готовят путем двукратного растворения в аммиаке (без нагревания) и осаждения уксусной кислотой. 3. 0,2 М фосфатный буфер (рН 7,16); смесь 3 объемных частей 0,2 М KH₂PO₄и 7 частей 0,2 М Nа₂НРO₄. 4. 0.7 н аммиачный буфер рН 8.9: смесь 1 объемной части 0,7 н раствора аммиака (проверенного титрометрически) с 4 частями 0.7 н раствора NH₄Cl. Буфер можно хранить 1-2 недели. 5. 5% раствор казеина, содержащий кальций. Готовят каждый раз в день проведения определения. На одно определение энтерокиназы требуется 0,75-1 г очищенного казеина (указанного выше). На 1 г казеина берут 1,1 мл 1,15% раствора молочнокислого кальция и 9 мл 0.1 н раствора аммиака (проверенного титрометрически). Казеин заливают раствором молочнокислого кальция, тщательно перемешивают, добавляют аммиак и после растворения казеина раствор помещают на холод при температуре от О до 4°С.

Оборудование. 1. Цилиндрической формы бюксы диаметром 2.5 см (несколько десятков). 2. Черные фотографические кюветы. 3. Пипетки, калиброванные на 2 мл с выдуванием. 4. Центрифуга 2.500-3000 об/мин. 5. Термостат. 6. Торсионные весы. 7. Ступки.

Ход определения. Готовят йодную вытяжку фекалий (1:10) путем растирания их в ступке с кварцевым песком илиизмельченным стеклом при постепенном добавлении воды. Спустя 30 мин. осадок отделяют центрифугированием; если вытяжка имеет кислую реакцию на лакмус, ее нейтрализуют добавлением аммиака изатем разводят водой вдвое (разведение материала 1:20). Если ожидают высокое содержание энтерокиназы. Разводят еще в 10 раз (1;200), иногда даже в 100 раз (1:1000). В 7-10 бюксах готовят ряд геометрически возрастающих разведений так, что количество исследуемого материала убивает на 1/3 в каждом последующем сосуде по сравнению с предыдущим. Для этого во все бюксы, кроме первого, наливают по 1 мл дистиллированной воды, в первый наливают 1 мл разведенной вытяжки. Путем двукратного набирания в пипетку и обратного выдувания вытяжку перемешивают с содержащейся во втором бюксе водой. Из второго бюкса 2 мл смеси переносят в третий, где таким же образом перемешивают, снова переносят в следующий бюкс и т. д. Из последнего бюкса 2 мл смеси отбрасывают. Во все бюксы прибавляют по 2 капли раствора фосфата рН 7,16 (реактив №3) и по 0.03 г препарата трипсиногена (реактив №1). Навески препарата по 0.03 г в нужном количестве подготовляют еще до начала определения. Удобно пользоваться для этого торсионными весами. После прибавления препарата, смеси взбалтывают и помещают для активирования в термостат на час при 37°С. После этого во все сосуды быстро прибавляют по 0.5 мл 0,7 н аммиачного буфера рН 8,9 (реактив №4) и по 2 мл 5% раствора казеина, содержащего кальций (реактив №5), взбалтывают, переставляют на нагретую в термостате подставку с темным дном и вновь инкубируют при 37°С в течение 10 мин, после чего регистрируют результат. При надлежащем предварительном разведении материала казеин в нескольких бюксах с большим содержанием энтерокиназы оказывается переваренным. а в других - створоженным, что легко различимо невооруженным глазом. Регистрируют последнюю переваренную порцию, содержание энтерокиназы в которой равно одной условно принятой единице. Отсюда простой расчет даст содержание этого фермента в 1 мл или 1 г первоначально взятого исследуемого материала: Е=Р/а, где а -количество разведенной вытяжки в последней переваренной порции; Р - предварительное разведение.Возможная ошибка таких определений равняется 1/6 - 1/4 находимого количества единиц.

Клиническое значение. В фекалиях здоровых взрослых людей содержится от следов до 20 ед/г энтерокиназы. Характер (до 10 дней) пищи мало влияет на содержание фермента, только после очень резкого изменения диеты на 2-3-й день оно может быть несколько повышено -50-60 ед/г. Концентрация энтерокиназы зависит главным образом от состояния функции толстых кишок и деятельности нормальной кишечной микрофлоры. При их нарушении находят 200 ед/г и более, а при острых кмшечных заболеваниях с диареей - до 2000-3000 ед/г. У детей первых 2 лет жизни внорме высокое содержание - энтерокиназы в фекалиях, в возрасте около года - 700-800 ед/г.

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ КОПРОГРАММЫ

Поиск по сайту: