Лабораторная диагностика. Лабораторные методы диагностики бешенства имеют исключительно важное значение

Лабораторные методы диагностики бешенства имеют исключительно важное значение. Для лабораторной диагностики при жизни животного берут пробы слюны и отпечатки с роговицы (кронеальная проба). Исследование проводят с помощью метода флюоресцирующих антител (иммунофлюоресцирующий метод прямой и не прямой).

После смерти животного для исследования в лабораторию посылают голову или целиком труп. Если животное крупное и посылать голову или труп целиком не возможно, извлекают мозг и посылают его упакованным в водонепроницаемую тару.

Лабораторная диагностика включает: обнаружение вирусного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша – Негри и биопробу на белых мышатах.

РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин.

Методика постановки РИФ. На обезжиренных предметных стеклах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов головного мозга лавой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок и продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус15-20⁰С) от 4 до 12 ч, высушивают на воздухе, наносят флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влажную камеру при 37⁰С на 25-30 мин, затем тщательно промывают физическим раствором или фосфатным буфером с pH7,4, споласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом. В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства, наблюдается разной величины и формы флуоресцирующие желто-зеленым цветом гранулы в нейронах, но чаще вне клеток. В контроле подобного свечения не должно быть, нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах. Отрицательным считают результат при отсутствии специфической флуоресценции.

Материал от животного, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и т.д., а также материал, имеющий признаки даже незначительного загнивания.

РДП в агаровом геле. Метод основано на свойстве антител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген + антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспериментальной инфекции (биопроба).

Реакцию ставят на предметных стеклах, на которые наливают 2,5 -3 мл расплавленного 1,5%-ног раствора агара. После застывания в агаре делают лунки по трафарету диметром 4-5 мм, помещенному под предметное стекло с агаром. Агаровые столбики вынимают ученическим пером. Лунки в агаре заполняют компонентами по схеме.

От крупных животных исследует все отделы головного мозга (левый и правой стороны), от средних (крыс, хомяки и др.) – какие-либо три отдела мозга, у мышей – вес мозг. С помощью пинцета из мозга готовят пастообразную массу, которую и помещают в соответствующие лунки.

Контроли с положительным и отрицательным антигенами ставят на отдельном стекле по тому же трафарету.

После заполнения лунок компонентами препараты помещают во влажную камеру и ставят в термостат при 37⁰С на 6 ч, затем при комнатной температуре на 18 ч. Учет результатов ведут в течение 48 ч.

Реакцию считает положительной при появлении одной или 2-3 линий преципитации любой интенсивности между лунками, содержащими суспензию мозга и антирабический гамма-глобулин.

Бактериальная нестерильность и загнивание, и загнивание мозга не препятствуют использованию его для РДП. Материал, консервированный глицерином, формалином и другими средствами, для РДП не пригоден.

Выявление телец Бабеша – Негри. На предметных стеклах делают тонкие мазки или отпечатки из всех отделов головного мозга (как для РИФ), не менее двух препаратов с каждого отдела мозга, и окрашивают по одному из методов (по Селлерсу, Муромцеву, Манну, Ленцу и т.д.).

Положительным результатом считают наличие телец Бабеша – Негри – четко очерченных овальных или продолговатых гранулированных образований розово-красного цвета, расположенных в цитоплазме клеток или вне их.

Данный метод имеет диагностическое значение только при обнаружении типичных специфических включений.

Биопроба. Она более эффективна по сравнению со всеми указанными выше методами. Ее ставят при получении отрицательных результатов предыдущими методами и в сомнительных случаях.

Для биопробы отбирают белых мышей массой 16-20 г, нервную ткань из всех отделов головного мозга растирают в ступке со стерильным песком, добавляют физиологический раствор до получения 10%-ной суспензии, отстаивают 30-40 мин и используют надосадочную жидкость для заражения мышат. При подозрении на бактериальное загрязнение добавляют на 1 мл суспензии 500 ЕД пенициллина и стрептомицина и выдерживают 30-40 мин при комнатной температуре.

На одну биопробу заражают 10-12 мышат: половину интрацеребрально по 0,03 мл, половину подкожно, но в область носика или в верхнюю губу по 0,1-0,2 мл.

Зараженных мышат помещают в стеклянные банки (лучше аквариумы) и наблюдают за ними в течение 30 дней, ведя ежедневную регистрацию. Гибель мышей в течение 48 ч считают неспецифической и не учитывают в оценке результатов. При наличии вируса бешенства в патматериале с 7-10-го дня по: горбатость спины, нарушение координации движений, паралич задних затем передних конечностей и гибель. У павших мышей головной мозг исследует в РИФ, на обнаружение телец Бабеша – Негри и ставят на РДП.

Биопробу на бешенства считают положительной, если в препаратах из мозга зараженных мышат обнаруживают тельца Бабеша – Негри или выявляют антиген методами РИФ и РДП. Отрицательный диагноз – отсутствие гибели мышат в течение 30 дней.

Рис.6. 4—9. Выявление телец Бабеша—Негри (т. Б. —Н.) в цитоплазме нервных клеток при различных методах окраски. Рис. 4 и 8. Крупные т. Б. —Н. (рис. 4—темно-красного цвета, окраска по Селлерсу; ×900 и рис. 8—оранжевого цвета, окраска сафронином, импрегнация серебром; ×900) с множеством базофильных гранул (черные точки). Рис. 5—7 и 9. Т. Б. —Н. (красного цвета). Рис. 5—окраска по Манну; ×680. Рис. 6—окраска по Гимзе; ×680. Рис. 7—окраска фуксин - сафронином; ×680. Рис. 9—окраска по Гимзе; ×900.

Поиск по сайту: