Лабораторно - практическое занятие № 14

Тема: Азотфиксация.

Цель работы: Ознакомить студентов с симбиотическими и свободноживущими азотфиксаторами. Микроскопирование азотфиксирующих бактерий.

Процесс фиксации атмосферного азота бактериями имеет большое значение для общего баланса азота в почве. Он входит в число приоритетных научных проблем, определяя в значительной степени достаточность обеспечения растений доступ­ными формами азота.

Ассимиляцию молекулярного азота, имеющую значение для земледелия, осуществляют прокариоты, которых в зави­симости от их взаимоотношений с растением делят на 3 группы.

1. Живущие в симбиозе с растением — симбиотические азотфиксаторы.

2. Ризосферные (корневые) и филлосферные (листовые) бактерии, формирующие ассоциации с различными видами небобовых растений, — ассоциативные азотфиксаторы.

3. Свободноживущие почвенные азотфиксаторы — живут независимо от присутствия растения: вне ризосферы, в почве пара, даже в почве дорог.

Все они диазотрофы, т. е. могут использовать для питания и молекулярный, и минеральный азот. Ежегодно только на поверхности суши бактерии фиксируют до 200 млн т азота и от 30 до 190 млн т – в водных экосистемах.

Симбиотические азотфиксаторы. Симбиотическая азотфиксация – это способность бактерий связывать молекулярный азот, находясь в симбиозе с высшими растениями. Более чем 1300 видов бобовых растений и более 200 видов небобовых древесных и кустарниковых пород (ольха, облепиха, мох и другие) имеют клубеньки на корнях. Клубеньковые бактерии относятся к родам Rhizobium (преимущественно), Bradyrhizobium, Azorhizobium и другим.

Внедрившись в ткань корня, эти бактерии распространяются обычно в виде инфекционных нитей - колоний размно­жившихся клеток бактерий. В зрелой клубеньковой ткани бактериальные клетки превращаются в бактероиды. В отличие от бактериальной клетки, имеющей форму палочки, бактероиды — грушевидные, сфери­ческие или ветвистые образования в 3—4 раза более крупных размеров. Зона клубенька с клетками как бактериальной, так и бактероидной формы получила название бактероидной.

На питательных средах клетки ризобий — подвижные, не образующие спор грамотрицательные палочки. Среди них встречаются и кокковидные клетки. В старых культурах клетки крупнее, палочковидные, неподвижные, изредка встречаются Т-образные бактероидные формы. По скорости роста клубеньковые бактерии делят на медленнорастущие, например Bradyrhizobium japonicum у люпина, сои, и быстрорастущие — у гороха, клевера и др.

Строение клу­беньков бобовых изучают на срезах, которые делают острой ботанической бритвой. Тонкий срез, продольный или поперечный, помещают на предмет­ное стекло и просматривают в раздавленной капле при разных увеличениях. В сухой системе просматривают структуру клубенька, обнаруживают бактероидную ткань, а затем при достаточной тонкости среза препарат исследуют с иммерси­онной системой, где хорошо видна бактероидная зона клу­бенька.

Для знакомства с формами разных видов клубеньковых бактерий готовят фиксированные и окрашенные препараты из бактероидной ткани клеток клубенька. Если клубенек доста­точно крупный, его разрезают бритвой на две части и поверх­ность среза многократно прокалывают стерильной иглой, вы­зывая возможно большее механическое разрушение клеток. За­тем из него отжимают каплю на предметное стекло и готовят фиксированный и окрашенный препарат. Мелкие клубеньки (2—3) помещают на предметное стек­ло, добавляют каплю воды и прижимают другим предметным стеклом. Выдавленное содержимое размазывают по стеклу, ма­зок сушат, фиксируют и красят карболовым эритрозином, фуксином или генцианом фиолетовым.

Хорошая окраска получается при использовании смеси равных частей фуксина и метиленового синего, растворенных в 1%-ном растворе уксусной кислоты. В смеси красок препарат выдерживают 3—5 мин. Ткань клубенька окрашивается в синий цвет, а бактерии — в красный.

Свободноживущие азотфиксирующие бактерии. Среди свободноживущих азотфиксирующих бактерий наиболь­ший интерес представляют виды родов Clostridium и Azotobacter.

Clostridium pasteurianum — облигатный анаэроб. Энергию для всех про­цессов жизнедеятельности, в том числе и ассимиляции атмосферного азота, бактерии этого вида получают за счет маслянокислого брожения. Сбраживают моно -, дисахара и некоторые полисахариды.

В молодой культуре клетки С. pasteurianum имеют форму палочек с перитрихально расположенными жгутиками. Затем клетка образует спору, которая иногда располагается ближе к краю, но чаще — в середине клетки. Споры овальные, окру­жены капсулой. Клетки имеют клостридиальную форму, на­капливают запасное питательное вещество — гранулезу (поли­сахарид, близкий к крахмалу), окрашивающуюся при воз­действии раствора Люголя в сине-фиолетовый цвет. В период образования спор гранулеза постепенно исчезает. Анаэробные азотфиксаторы широко распространены в природе. Они встречаются почти повсеместно в почвах и за­грязненных водоемах.

Чистую культуру С. pasteurianum выделяют из колоний, по­лученных при посеве накопительной культуры после обязатель­ной ее пастеризации на агаризованную среду Виноградского или на картофельно-морковный агар Емцева: картофельный отвар — 500 мл; морковный отвар — 500 мл; глюкоза — 20 г; К₂НРО₄ — 1 г; MgSO₄ * 7Н₂О - 0,5 г; NaCI, MnSO₄ * 4Н₂О, FeSO₄ * 7Н₂О - следы; пептон 5 г; дрожжевой автолизат — 0,02 мл; СаСО₃ — 40 г; агар — 6 г. Отвары готовят следующим образом: по 0,5 кг очищенных картофеля и моркови заливают 2 л дистиллированной воды, кипятят 10 мин, фильтруют, затем добавляют дистил­лированную воду до первоначального объема.

Azotobacter chrocooccum фиксирует азот в аэробных условиях. Коло­нии азотобактера — темно-коричневого, почти черного цвета. В жидких культурах бактерии образуют пленку, а на агаре и на гелевых пластинах — слизистые колонии.

Клетки азотобактера плеоморфные — от палочковидных до кокковидных. Располагаются одиночно, парами, часто окружены слизистой капсулой, которая выявляется после окраски клеток фуксином и смешивания с разбавленной тушью. Внутри клеток ясно выра­жена зернистость. A. vinelandii на плотных средах образует сарциноподобные скопления. Азотобактер более требователен к условиям окружающей среды, поэтому менее распространен в поч­ве, чем С. pasteurianum. В качестве источника углерода усваивает моно-, дисахара, спирты и соли органических кислот, в том числе и бензойную.

Для выявления азото­бактера в почве и определения относительного его содержания можно использовать метод Виноградского. Отмытые от следов хлора гелевые пластины пропитывают 3—5 мл питательной среды следующего состава (г/200 мл дистиллированной воды): маннит или тростниковый сахар - 20,0; К₂НРО₄ - 1,0; MgSO₄ * 7Н₂О - 0,5; NaCI - 0,5; FeSO₄*7H₂O - 0,01; MnSO₄*4H₂O - 0,01; СаСО₃ - 5,0. После упаривания среды до исчезновения избыточной влаги на поверхности геля раскладывают по трафарету 50 комочков почвы. Смоченной водой палочкой с оттянутым концом, предварительно проводя ее каждый раз над огнем, захватывают комочки почвы диаметром примерно 2 мм и помешают их на поверхность гелевой пластины. Элективность среды создают отсутствием связанного азота и аэробными условиями. Чашки с посевом помещают во влажную камеру, и после 5—6 сут инкубации при наличии клеток азотобактера комочки почвы обрастают его колониями.

Для сравнительной оценки заселенности азотобактером разных почв для каждой из них определяют степень обрастания азотобактером комочков почвы по отношению обросших коло­ниями комочков почвы к общему числу комочков на чашке. Это дает возможность установить, какая почва богаче азотобактером.

Для выделения чистой культуры азотобактера после про­верки накопительной культуры под микроскопом делают посев на агаризованную среду Эшби следующего состава (г/л водо­проводной воды): маннит — 20,0; К₂НРО₄ — 0,2; MgSO₄* 7H₂O – 0,2; NaCI — 0,2; K₂SO₄ - 0,1; CaCO₃ - 5,0; агар — 20,0. Добавляют смесь микроэлементов по Федорову — 1 мл.

Контрольные вопросы:

1. Что такое азотфиксация?

2. Перечислите бактерии, способные осуществлять фиксации атмосферного азота.

3. Свободноживущие азотфиксаторы.

4. Симбиоз азотфиксаторов с бобовыми растениями.

5. Назовите фермент, с помощью которого осуществляется азотфиксация.

6. Кто открыл анаэробную азотфиксирующую бактерию?

7. Каково значение процесса азотфиксации в растениеводстве?

Поиск по сайту: