Вопрос 58. Палочка инфлюэнцы

/. Заболевания, вызываемые палочкой инфлюэнцы

2. Морфология, биология, культуральные и антигенные свойства

3. Лабораторная диагностика

1. Бактерии инфлюэнцы Haemophilus influenza (б. Афанасьева-Пфейффера), встречаясь довольно часто на слизистой оболочке верхних дыхательных путей человека, при ослаблении устойчивости организма к инфекции могут вызвать менингит (особенно у ослабленных детей), острые воспаления дыхательных путей:

• пневмонию;

• бронхит;

• ларингит;

• конъюнктивит;

• острый и хронический отит и др.

2. Морфология: маленькая палочка почти кокковидной формы. Очень полиморфны, могут образовывать нити. Неподвижны, спор не образуют, грамотрицательны. Бактерии медленно ок­рашиваются анилиновыми красками; окраску мазка карболо­вым фуксином, разведенным в 10 раз, нужно производить в течение 5—15 мин.

Биология, культуральные свойства: большую роль при выращи­вании на питательных средах играют ростовые витамины — кровь различных животных или водный раствор хлористого гематина и дрожжевой экстракт.

Антигенное строение: серотипы — капсулы отдельных штаммов отличаются по антигенным свойствам в связи с присутствием в них 6 различных полисахаридов.

По капсульным антигенам бактерии инфлюэнцы разделяются на 6 типов: а, Ь, с, d, e, f. У людей чаще выделяется тип Ь. С помощью капсульных антигенов можно получить специфи­ческие антисыворотки с высоким титром, применение которых дает возможность быстро и точно определить серологические типы палочки инфлюэнцы.

3. При воспалении дыхательных путей и среднего уха берут слизь и гной с помощью тампона, при пневмонии собирают мокроту в чашку Петри; при эмпиеме плевры исследуют экссудат, а при менингите — спинномозговую жидкость.

Микроскопия и бактериоскопическое исследование: посев делают на кровяной (шоколадный) агар Левинталя и одновременно на свежий кровяной агар с 10% крови кролика или лошади. Па­лочка инфлюэнцы очень неустойчива во внешней среде, быст­ро погибает при высыхании слизи, мокроты, гноя, поэтому по­сев необходимо делать немедленно после взятия материала. На среде Левинталя колонии бактерий вырастают довольно больших размеров, слепки беловатые с гладкой поверхностью, ровные, круглые (у капсульных бактерий). У некапсульных штаммов колонии меньше с неровными краями и выпуклым центром. С колоний делают мазки на предметном стекле, ок­рашивают фуксином Циля и микроскопируют.

Типичные бактерии подвергают серологическому исследова­нию и пересевают на жидкие среды для дальнейшего исследо­вания. При пересеве с колоний на жидкие кровяные среды {бульон Левшталя) палочка инфлюэнцы дает гомогенный рост с небольшим осадком на дне. Коккообразные формы дают равномерную слизь. Нитевидные формы дают хлопья. Для ди­агностики применяют реакцию преципитации с различными жидкостями, полученными от больного.

Вопрос 59. Возбудители кокковых пневмоний и их лабораторная диагностика

/. Возбудители пневмоний

2. Микроскопическое исследование

3. Бактериологическое исследование

4. Особенности лабораторной диагностики стафилококковых пневмоний

1. Возбудителями пневмонии могут быть различные микроорганиз­мы, проникающие в дыхательные пути человека из окружающей среды, — кокковые (пневмококки, стрептококки, стафилокок­ки) и бациллярные (диплобациллы Флидлендера, палочки Пфейффера). Одним из наиболее частых возбудителей пнев­монии, особенно крупозной, является пневмококк. В последнее время часты стафилококковые пневмонии.

2. Материалом для исследования служат: мокрота, слизь, взятая стерильным тампоном из носоглотки больного, гной, различ­ные выпоты, пунктаты, кровь. Исследованию подвергают пре­имущественно мокроту или носоглоточную слизь.

Микроскопическое исследование: делают мазки на 2 предметных стеклах; один из мазков окрашивают по Граму, а другой — раз­веденным карболовым фуксином (краска Пфейффера). При на­хождении в мазках ланцетовидных диплококков, окруженных светлой зоной неокрасившейся капсулы, ориентировочно ус­танавливают пневмококковую этиологию. Обнаружение распо­ложенных цепочкой грамположительных кокков позволяет по­давить предварительный диагноз стрептококковой инфекции.

Характерная морфология расположения группами в виде гроз­дей винограда и положительной окраски по Граму позволяет установить наличие стрептококков. Обнаружение в мазках мелких грамотрицательных палочек, часто образующих гнезд-ные скопления и нередко полярно окрашенных, указывает на палочку Пфейффера. Грамотрицательные диплобациллы различ­ной величины, окруженные капсулой в виде светлого ореола, говорят о наличии диплобациллы Фридлендера. Микроскопиче­ский диагноз ориентировочный и предварительный.

3. Точное представление о микробном пейзаже дает:

• изучение посевов на кровяном агаре и других средах;

• выделение чистых культур из изолированных колоний;

• идентификация их.

Пневмококковые пневмонии: для бактериологического иссле­дования материал засевают на чашки Петри, содержащие агар с добавлением 5—7% дефибринированой кроличьей крови. По­севы на кровяном агаре исследуют через 1—2 суток содержания в термостате при 37 °С.

Одновременно с изучением внешнего вида колоний произво­дят отсев их в жидкие среды и микроскопирование. Колонии пневмококков на кровяном агаре имеют вид мелких полупро­зрачных образований зеленовато-серого цвета, особенно за­метного в тонком слое агара, в центре имеют небольшой плот­ный бугорок и более светлую периферию. Нередко колонии окружены как бы отсвечивающим ореолом. В жидких средах пневмококки вызывают равномерное помутнение без образо­вания пленок и осадка.

Микроскопирование обнаруживает грамположительные парные кокки несколько удлиненной формы с заостренными наруж­ными концами, напоминающими ланцет — ланцетивидные ди­плококки. Размеры их колеблются в пределах 0,5 х 0,75 до 1 х 1,5 мкм, располагаются одиночно, но могут образовывать ко­роткие цепочки по 3—4 пары кокков. Пневмококки образуют капсулу, которая светлым ободком окружает оба кокка вместе, так как обычными методами окраски капсула не прокрашива­ется. Пневмококки легко лизируются в присутствии бычьей желчи и желчнокислых солей. Обнаруженные при исследова­нии культуры пневмококка подвергают дополнительному исследованию - определяют тип пневмококка, вирулентность для белых мышей и устойчивость к действию антибиотиков, а также производят серологические исследования (реакции агг­лютинации и преципитации — берется материал от больного и типовые пневмококковые сыворотки). Одновременно с посе­вом на агар исследуемый материал вводят внутрибрюшинно 2 белым мышам весом 18—20 г по 0,5 мл, т. е. ставят биологи­ческую пробу.

4. Стафилококковая пневмония. Бактериологическое исследование

Серологическое исследование — наибольшее распространение получило определение уровня стафилококкового антитоксина в сыворотке больных в динамике, т. е. в начале и в конце бо­лезни. Принцип титрования основан на нейтрализации гемоли­тических свойств стафилококкового токсина антитоксином, содержащимся в сыворотке больного. Обычно при наличии стафилококкового заболевания уровень антитоксина в крови больных нарастает в течение болезни, что подтверждает этио­логическую роль стафилококка в данном заболевании. У резко ослабленных субъектов нарастание титра антитоксина может и не наблюдаться.

Вопрос 60. Возбудитель малярии

/. Морфологические и культуральные свойства возбудителя малярии

2. Цикл развития малярийного плазмодия

3. Спорогония

4. Шизогония — тканевая и эритроцитарная

5. Половое размножение плазмодиев

Острый антропонозный трансмиссивный протозооноз. Возбу­дители малярии — одноклеточные животные (простейшие), от­носятся к классу спорозоа, подклассу кокцидиа, семейству плазмодий, роду плазмодиум. У человека известно 4 вида воз­будителей малярии:

• плазмодии вивакс (p. vivax) — возбудитель трехдневной малярии;

• плазмодии малярии (p. malariae) — возбудитель четырехдневной малярии;

• плазмодии фальсипарум (p. falciparum) — возбудитель тропиче­ской малярии;

• плазмодии овале (p. ovale) — возбудитель особой формы трех­дневной малярии.

Последний вид в естественных условиях встречается в Африке, Палестине, Южной Америке, на Филиппинах. В России суще­ствование овале не установлено. Человек в естественных усло­виях может заразиться через комаров возбудителем малярии обезьян.

2. Цикл развития малярийных возбудителей осуществляется со сменой хозяев:

• половое развитие (спорогония) протекает в организме оконча­тельного хозяина — самки комара рода анофелес;

• бесполое развитие (шизогония) — в организме промежуточного хозяина — человека).

3. Спорогония — попавшие в желудок комара с кровью человека мужские и женские половые клетки плазмодиев (микро- и мак-рогаметоциты) превращаются в зрелые микро- и макрогаметы, которые после оплодотворения проходят ряд последовательных этаггов развития (от зиготы до спороцисты) инвазионных форм спорозоитов, накапливающихся в слюнных железах насекомого. Продолжительность спорогонии определяется видом плазмо­диев и температурой окружающего воздуха. При оптимальной температуре воздуха (25 °С) спорогония продолжается 10 дней у плазмодиев вивакс, 12 дней - у фальсипарум и 16 дней -у малярие и овале. При температуре воздуха ниже 15 °С споро-зоиты не развиваются. Дальнейшее развитие спорозоиты полу­чают в организме позвоночного хозяина, в который они про­никают при кровососании комара.

4. В организме человека малярийные паразиты проходят бесполое размножение, или шизогонию:

Тело малярийного паразита состоит из цитоплазмы и ядра. Не­которые стадии паразитов содержат пигмент, который окраски не воспринимает, а имеет свой естественный цвет: темно-бурый, золотисто-желтый, коричневый, почти черный (разный у разных видов паразитов).

Заражение человека происходит в результате укуса зараженного комара рода анофелес. Со слюной такого комара в организм человека попадают спорозоиты. Тканевая шизогония протекает в клетках печени. Спорозоиты внедряются в них, округляются, растут, достигая в поперечнике 40—50 мкм и более. В них мно­гократно делится ядро, а затем сегментируется цитоплазма. В ре­зультате образуются тканевые мерозоиты. Часть мерозоитов проникает в эритроциты и дает начало эритроцитарному циклу развития паразитов. Другие мерозоиты проникают вновь в клетки печени, в которых продолжается развитие тканевых форм. Стадии паразитов, развивающиеся в клетках печени, на­зывают тканевыми, или экзоэритроцитарными, формами. Раз­личают также формы преэритроцитарные, развитие которых в тканевых клетках проходит параллельно развитию эритроци-тарных форм. Минимальная продолжительность экзоэритрици-тарной шизогонии составляет 8 суток у пл. вивакс, 6 суток у пл. факсипарум, 9 суток у пл. овале и 19—16 суток у пл. малярие. Вследствие политипичности спорозоитов пл. вивакс и пл. ова­ле часть из них (до 8—13 мес после инокуляции) обеспечивает развитие болезни после продолжительной инкубации или воз­никновение истинных или отдаленных рецидивов болезни. Эритроцитарная шизогония пл. вивакс, пл. малярии и овале протекает в периферической крови. Возбудитель пл. фальсипа­рум в периферической крови обычно встречаются только ши-зонты, кольца.

Остальные стадии шизогонии вплоть до разделения паразита на мерозоиты и развития половых форм (гамоитов) протекают во внутренних органах. Только в случаях тяжелой коматозной малярии в периферической крови могут наблюдаться и другие стадии цикла шизогонии.

У некоторых штаммов пл. фальсипарум все стадии шизогонии можно обнаружить в периферической крови у значительной час­ти больных и при относительно легком течении болезни.

5. Размножение паразитов в эритроцитах протекает в виде регу­лярно сменяющихся циклов. От проникновения мерозоита в эритроцит до завершения развития паразита, заканчивающего­ся образованием новых мерозоитов, у пл. вивакс, пл. фальси-парум и пл. овале проходит 48 ч, у пл. малярие — 72 ч. Часть мерозоитов, проникающих в эритроциты, превращаются в мужские и женские половые клетки — гамонты (мужские — микрогамонты, женские — макрогамонты).

Женские гамонты достигают стадии полной зрелости — стадии гаметы в крови человека, мужские гаметы дозревают в организ­ме переносчика. По завершении процесса созревания в желуд­ке комара наблюдается процесс выбрасывания мужским гаме-тоцитом 4—8 мужских гамет, которые после отшнуровывания активно двигаются в содержимом желудка, способны прони­кать в женскую гамету и ее оплодотворять (половой процесс). При пл. фальсипарум гаметоциты сначала принимают округ­лую форму и лишь затем образуются микрогаметы.

Оплодотворенные женские гаметы (зиготы) проникают сквозь эпителий средней кишки (желудка) комара и под наружной ее оболочкой образуют ооцисты. Ооцисты растут, в них формиру­ется большое число спорозоитов — одноядерных веретеновид-ных образований (длина 11-15 мкм, ширина 1—1,5 мкм).

Цисты разрываются, и из них выходят спорозоиты, которые, распространяясь с гемолимфой по тканям комара, попадают в его слюнные железы, после чего комар становится способным передавать малярию человеку. Заражение малярией может на­ступит не только через укус комара, но при переливании крови от донора, у которого в крови имеются паразиты, даже в весь­ма малом количестве.

Вопрос 61. Лабораторная диагностика малярии

/. Обнаружение плазмодиев в толстой капле и мазке крови

2. Морфология малярийных паразитов в мазке и толстой капле

3. Ошибки диагностики

4. Исследование комаров на зараженность малярийными паразитами

1. Паразитологический диагноз малярии основан на обнаружении паразитов в окрашенных препаратах (толстая капля и мазок) крови. Паразиты могут присутствовать в крови не только во время лихорадочных приступов и промежутков между присту­пами, следующими один за другим, но и в течение длительных периодов, на протяжении которых не наблюдается повышения температуры.

Наличие паразитов в крови при отсутствии лихорадочных при­ступов называется паразитоносительством. Такие люди зараз­ны для комаров. При массовых обследованиях следует брать кровь вне зависимости от наличия приступов. Техника приготовления и окраски мазка — мазок готовят как обычно. После того как мазок высохнет, его фиксируют в 96%-ном этиловом спирте 15 мин или в метиловом спирте в течение 3 мин. Высушенные после фиксации мазки окраши­вают краской Романовского, разведенной дистиллированной водой, ркрашивают в течение 30—50 мин, в зависимости от качества краски. После окрашивания препарат споласкивают водой и высушивают на воздухе.

Техника приготовления и окраски толстой капли. На стекле при­готовляют мазок, а потом на еще влажный мазок дают упасть капле крови. Капля равномерно растекается, образуя круг. По­сле того как капля высохнет, на мазке простым карандашом делают соответствующую отметку. Препарат без фиксации ок­рашивают. Затем осторожно (чтобы не смыть каплю) препарат споласкивают водопроводной водой и высушивают. Мазки и толстые капли микроскопируют имммерсионной системой. 2. Морфология малярийных паразитов в мазке крови. Мерозоит, внедрившись в эритроцит, превращается в молодой шизонт, имеющий вид кольца. Затем паразит, увеличиваясь, принимает амебовидную форму, при этом сохраняется просвет (вакуоль) между ядром паразита и основной частью его цитоплазмы. В цитоплазме паразита появляются зерна пигмента. Амебовид­ный шизонт заполняет значительную часть эритроцита, затем начинает округляться, вакуоль исчезает (стадия подготовки к делению), пигмент начинает собираться в отдельные пучки. Для плазмодия малярии шизонты — лентовидные формы. Ядро паразита начинает делиться, а затем цитоплазма паразита де­лится так, что к каждому дочернему ядру прилегает отдельный комочек цитоплазмы (меруляция). В результате получается кучка мерозоитов — морула. Пигмент на стадии морулы собран в одну компактную кучу.

У пл. фальсипарум скучивание пигмента наступает еще до пол­ного формирования морулы. Мерозоиты расходятся, попадают в плазму крови, часть из них погибает, часть внедряется в но­вые эритроциты.

Гамонты. Форма гамонтов у всех малярийных паразитов, за исключением тропической малярии, круглая или слегка оваль­ная. При тропической малярии плазмодий имеет вытянутые гамонты с закругленными концами. Мужские и женские гамон­ты различаются между собой по величине и структуре ядра (интенсивности окраски цитоплазмы). Женские гамонты — яд­ро небольшое, компактное; цитоплазма красится в интенсив­ный голубой цвет. Мужские гамонты — ядро большое, цито­плазма красится бледно, часто зона вокруг ядра принимает фиолетовый оттенок.

Морфология малярийных паразитов в толстой капле. В толстой капле, поскольку ее окрашивают в нефиксированном виде, эритроциты выщелачиваются, а малярийные паразиты претер­певают значительную деформацию. При четырехдневной и тропической малярии пораженные эритроциты в толстой капле выщелачиваются полностью, так же как и нормальные. При трехдневной малярии в толстой капле строма эритроцитов со­храняется и диагностика малярийного паразита по толстой ка­пле облегчается. Кольца в толстой капле обычно смяты, вытя­нуты в виде восклицательного знака, иногда разорваны в виде запятой. Амебовидные шизонты часто бывают уплотненными, лентовидные шизонты четырехдневной малярии в толстой ка­пле округляются и неотличимы от амебовидных шизонтов. Морулы распознаются в толстой капле легко. Цитоплазма паразитов в результате воздействия химиотерапев-тических препаратов окрашивается слабее, приобретает стекло­видный оттенок, становится вакуолизированной, распадается на отдельные комочки, ядро становится рыхлым или, наоборот, более компактным. Иногда пигмент собирается в кучки, вы­талкивает из паразита. В толстых каплях распознавание таких подвергшихся деформации паразитов становится более труд­ным, а иногда и невозможным.

Серологическая диагностика малярии включает иммунофер-ментную агглютинацию, реакцию непрямой гемагглютинации и др., которые имеют наибольшее значение в неэндемичных районах.

3. В мазках крови и толстых каплях малярийные паразиты могут быть приняты за мерозоит, скопление бляшек может симули­ровать морулу. В препаратах, окрашенных по Романовскому, бляшки отличаются от мерозоитов по следующим признакам: мерозоит состоит из красного ядра и голубой цитоплазмы. Фон бляшки в мазке иногда окрашивается в бледно-голубой цвет, однако ее зернистость принимает красный цвет более светлого оттенка, чем у ядер мерозоитов.

В препаратах могут быть обнаружены также посторонние мик­роорганизмы, по форме напоминающие малярийных паразитов: грибки, одноклеточные водоросли, свободноживущие простей­шие. Некоторые одноклеточные формы с компактным ядром в центре, окрашивающимся по Романовскому в ярко-красный цвет, симулируют гамонты тропической малярии. Их легко от-, лйчить по отсутствию пигмента. Свободноживущие простей­шие с одним или несколькими жгутами могут быть приняты за стадию образования мужских гамет малярийного паразита.

4. Комаров вскрывают и определяют наличие ооцист на желудке и спорозоитов в слюнных железах. Ооцисты видны в нативных препаратах.

Незрелые ооцисты выглядят в таких препаратах как круглые гомогенные образования с пигментом, состоящим из несколь­ких глыбок.

В зрелых ооцистах видны хорошо сформировавшиеся споро-зоиты, тесно прилегающие друг к другу. Ряды спорозоитов в виде частокола располагаются по отношению друг к другу под разными углами, в результате чего ооциста приобретает моза­ичный вид, при надавливании покровного стекла из ооцист выходят спорозоиты.

В слюнных железах спорозоиты расположены рядами перпен­дикулярно к протоку слюнных желез, а также в виде конгло­мератов. В секрете слюнных желез спорозоиты попадают в ок­ружающую жидкость, в которой хорошо заметны вследствие их подвижности.

Вопрос 62. Возбудитель эпидемического сыпного тифа

/. Морфология, биология и антигенные свойства риккетсий