Вопрос 64. Возбудитель чумы

1. Морфология возбудителя чумы

2. Устойчивость возбудителя чумы

3. Биология, культуральные свойства

1.Чума относится к особо опасным инфекциям и является типич­ным зоонозом с природной очаговостью. Грызуны (суслики, сурки, мыши, крысы) являются резервуаром инфекции в при­роде и передают ее один другому главным образом через блох. От больных грызунов (также через блох) может заразиться че­ловек, что ведет в дальнейшем к вспышкам чумы среди людей.

Морфология: возбудитель — Yersinia pestis, относится к роду иерсиниа, семейству энтеробактерий. Представляет собой непод­вижную, закругленную на конце овоидную палочку размерами 1,5-2 х 0,5-0,7 мкм. Описан полиморфизм возбудителей чумы с появлением удлиненных зернистых, нитевидных и фильт­рующихся форм.

Возбудитель чумы не образует спор, имеет капсулу, грамотрицателен, легко окрашивается анилиновыми красителями (более интенсивно на концах — биполярное окрашивание). В мазках из бульона бактерии чумы располагаются цепочками различ­ной длины обычно с хорошо выраженной биполярностью. На агаре с 3% поваренной соли можно обнаружить причудливые формы.

Микроб чумы при культивировании на искусственных пита­тельных средах в условиях повышенной температуры (37 °С) образует капсулы. Капсула лучше образуется на влажных и слегка кислых питательных средах. Жгутики отсутствуют.

2. Устойчивость возбудителя чумы вне организма к воздействию факторов среды неравнозначна. Понижение температуры увели­чивает сроки выживания бактерий, на пищевых продуктах и предметах обихода они сохраняются до 3 мес, в гное бубонов — 40 дней, в крови и мокроте — 1 мес и более. При температуре 55 °С они погибают через 10—15 мин, при 100 °С — спустя не­сколько секунд. Обычные дезинфекционные средства в рабо­чих концентрациях (сулема 1: 1000, 3—5%-ный раствор лизола, 3%-ный раствор карболовой кислоты, 10%-ный раствор из­весткового молока), антибиотики (стрептомицин, тетрациклин, левомицетин) оказывают губительное действие на палочку чу­мы. Бактерии чумы образуют эндо- и экзотоксин, содержат до 20 антигенов.

3. Культуральные свойства: возбудитель чумы — факультативный анаэроб. Хорошо растет на обычных жидких и питательных средах (мясо-пептонный агар, бульон) при температуре 25— 30 "С. Для стимуляции роста микроба чумы целесообразно прибавлять в питательную среду сульфит натрия, гемолизиро-ванную кровь, которые синтезируют дыхательные ферменты. На агаровых пластинах рост микроба чумы уже через 24 ч за­метен в виде нежного сероватого налета.

Колонии на агаре соответствуют R-форме (вирулентные); нача­ло развития колонии обнаруживается в виде появления очень маленьких рыхлых глыбок и затем плоских слоистых образова­ний с неровными краями, напоминающих кружевной платочек серовато-белого с голубоватым оттенком цвета. Колониям присущ полиморфизм.

На бульоне культура растет в виде хлопьев, взвешенных, в со­вершенно прозрачной жидкости с рыхлым осадком на дне. Возбудители чумы восстанавливают нитриты в нитраты, фер­ментируют с образованием пленки глюкозу, левулезу, мальтозу, галактозу, арабинозу, ксилозу и маннит, продуцируют дегидра-зы и уреазы. Желатин не разжижают, индол и сероводород не образуют.

Вопрос 65. Лабораторная диагностика чумы

1. Забор материала и микроскопическое исследование

2. Бактериологическое исследование

3. Биологическая проба

4. Ускоренные методы бактериологического исследования

5. Лабораторная диагностика чумы

1. Чума является чрезвычайно контагиозной, поэтому взятие ма­териала от больного (особенно легочной формы) производится с соблюдением мер предосторожности. Работа в очаге проводит­ся в полном противочумном костюме.

В лабораторию могут быть доставлены следующие материалы:

• содержимое бубона (легочная форма чумы);

• отделяемые язвы или пунктет из карбункула (кожная форма чумы);

• материал из зева, взятый тампоном, и мокрота (легочная фор­ма чумы);

• секционный материал (кусочки органов трупа, кровь);

• живые грызуны;

• трупы грызунов;

• блохи грызунов;

• вода;

• пищевые продукты.

Материал необходимо брать до назначения лечения. Значение микробиологического диагноза огромно, особенно для выявле­ния первых случаев чумы. Предварительный диагноз устанавли­вают на основании микроскопического исследования материала, окончательный — на основании выделения и идентификации культуры.

Микроскопическое исследование: мазки фиксируют погружением полностью в жидкость Инпифорова на 20 мин. Окраска по Граму обязательна во всех случаях. Одновременно окрашивают мазок метиленовым синим Леффлера, так как этот метод луч­ше выявляет биполярность.

2. Бактериологическое исследование: посевы исследуемого мате­риала производят на агар добавлением стимуляторов роста (кровь, сульфит натрия). При исследовании материала, обиль­но загрязненного посторонней микрофлорой (загнившие тру­пы, мокрота), к агару добавляют генциановый фиолетовый 1: 100 000. В случаях подозрения на наличие бактериофага по­севы обрабатывают антифаговой сывороткой. Инкубацию по­севов проводят при 28 °С. В положительных случаях через 12 ч появляются колонии в виде характерных "кружевных платочков". Когда чистая культура выделена путем прямого посева, она подлежит идентификации на основании следующих данных.

1. Морфологические и культуральные свойства возбудителя туляремии

2. Устойчивость к физическим и химическим факторам

3. Антигенное строение

4. Патогенность возбудителя туляремии

1. Для туляремии (Francisella tularensis) как одной из природно-очаговых зоонозных инфекций характерна триада биоиеноза:

• возбудитель;

• резервуары возбудителя;

• переносчики — кровососущие насекомые. Выделяют 3 подвида туляремийного микроба:

• неарктический (американский);

• среднеазиатский;

• голарктический (европейско-азиатский).

Неарктический подвид бактерии, в отличие от остальных, ха­рактеризуется высокой патогенностью для человека и лабора­торных животных.

Морфология: туляремийные бактерии имеют очень мелкие раз­меры — 0,3—0,5 мкм, способные проходить через некоторые бактериальные фильтры. При культивировании на искусствен­ных питательных средах микроб туляремии обычно имеет фор-. мы очень мелкого кокка, а в органах животных чаще встреча­ется в виде коккобактерий.

В культурах на питательных средах бактерии туляремии обна­руживают полиморфизм, особенно выраженный у американ­ской разновидности. Микроб неподвижен, спор не образует, имеет небольшую капсулу. В культурах характерно образова­ние бактериями слизи, легко обнаруживаемой при изготовлении мазков на стекле. Бактерии туляремии окрашиваются все­ми красками, обычно применяемыми в лабораторной практи­ке, но заметно бледнее, чем многие бактерии. По Граму туляремийные бактерии окрашиваются отрицательно. Мазки-отпечатки из органов окрашиваются по Романовскому-Гимзе, при этом туляремийные микробы отличаются от другой (посторонней) флоры более нежной фиолетовой окраской и более мелкими размерами.

Биология, культуральные свойства: микроб туляремии прихот­лив в отношении выращивания на искусственных питательных средах. Он не растет на обычном мясо-пептонном агаре или бульоне. Микробы удается культивировать на желтковых сре­дах при добавлении цистина и других питательных веществ, особенно крови. Температурный оптимум 36—37°С. Строгие аэробы. Изолированные колонии удобно получать при посеве на чашки со средой Емельяновой (гидролизат рыбной муки, же­латин, дрожжи, хлористый натрий, глюкоза, цистин, агар) или средой Френсиса — (мясо-пептонный агар с 1%-ным пептоном, 0,5%-ный хлористый натрий, цистин, глюкоза).

После стерилизации эти среды добавляют к 5—10 мл кроличьей дефибринированной крови. Колонии на этих средах — белова­того цвета с голубоватым оттенком, круглые, с ровным краем, выпуклые, гладкие, блестящие, при разреженном посеве они достигают (через несколько дней) 1—2 мм и более в диаметре.

В жидких питательных средах туляремийный микроб размно­жается хуже, причем рост отмечается лишь на поверхности среды, что связано с аэрофильностью бактерии. Хорошие ре­зультаты выращивания можно получить либо при добавлении к жидким средам коллоидов (куриного желтка, агара и т. д.), либо при аэрации среды. Способность сбраживать углеводы и спирты у микроба туляремии ограниченна. Туляремийные микробы ферментируют до кислоты глюкозу, мальтозу, а в ря­де случаев — левулезу и маннозу. Лактозу, сахарозу, маннит и ряд других веществ туляремийные бактерии не ферментируют.

2. Устойчивость к физическим и химическим факторам: во внеш­ней среде возбудитель сохраняется длительное время, особенно при низких температурах: в зерне и соломе при температуре ниже 0 °С до 6 мес, в замерших трупах животных — до 8 мес. В естественных условиях обнаруживали возбудители туляремии в воде ручьев, колодцев, а также в соломе и других объектах, это имеет важное эпидемиологическое значение. Туляремийные бактерии нестойки к высоким температурам — кипячение не­медленно убивает микробов, а нагревание до 60 °С обусловли­вает их гибель в течение 20 мин. Под действием прямых сол­нечных лучей туляремийные бактерии погибают через 20-30 мин, на рассеянном свету жизнеспособность их сохраняется до 3 дней.

Микроб туляремии нестоек к обычным дезинфицирующим веще­ствам - лизолу, фенолу, хлору, сулеме. Особенно чувстви­тельны бактерии к этиловому спирту и при его воздействии погибают менее чем за минуту.

3. Антигенное строение: туляремийный микроб содержит 2 анти­генных комплекса:

• оболочечный (Vi);

• соматический (О).

С оболочечным антигеном связаны вирулентность и иммуно-генные свойства возбудителя. При Vi-агглютинации, характер­ной для вирулентных культур, на дно пробирки в осадок выпа­дает стойкий агглютинат, при встряхивании легко разбиваю­щийся на мелкие хлопья; при О-агглютинации, свойственной полностью авирулентным культурам, в осадок выпадает не­стойкий агглютинат, при встряхивании легко разбивающийся на мелкие хлопья или почти гомогенную взвесь. Туляремийные бактерии обнаруживают антигенную близость с бруцеллами: специфическая туляремийная агглютинирующаяся сыворотка высокого титра может в небольших разведениях агг­лютинировать бруцелл, а бруцеллезная сыворотка - туляре­мийные бактерии. Некоторые сапрофитные бактерии также обладают способностью частично агглютинироваться туляре-мийной сывороткой. У музейных штаммов туляремийных бак­терий может наблюдаться бактериофагия, но этот феномен можно обнаружить лишь при посеве на чашки со специально подобранными средами.

4. Патогенность. Штаммы туляремийных бактерий, выделяемые в природных очагах от грызунов, клещей и других объектов, а также от больных людей, обладают в высокой степени сходны­ми признаками, включая вирулентность. Различия обнаружива­ются лишь между штаммами - американским и европейскоазиатским. При культивировании на искусственных питатель­ных средах происходит превращения туляремийных бактерий из вирулентной S-формы в авирулентную R-форму, их обозна­чают как SR-вариант. Они обладают остаточной вирулентно­стью для чувствительных к туляремии животных, например белых мышей.

Болезнетворные свойства туляремийного микроба в основном связаны с токсическими веществами, представляющими собой эндотоксин. Микроб туляремии патогенен для многих видов млекопитающих, и особенно грызунов, но степень его пато-генности не для всех видов одинакова.

Наибольшую восприимчивость и чувствительность к туляре­мии проявляют полевки, водяные крысы, зайцы, хомяки, до­мовые мыши и другие грызуны и насекомые. У этих животных даже при минимальных дозах заражения заболевание протекает по типу острой септицемии, они выделяют возбудителя в большом количестве с мочой и калом и погибают с необычай­но интенсивным обсеменением бактериями внутренних орга­нов и крови.

Вопрос 67. Лабораторная диагностика туляремии людей

/. Особенности лабораторной диагностики туляремии

2. Бактериоскопия

3. Серологические исследования

4. Проба с тулярином

5. Биологический метод

1.Организм человека восприимчив к туляремии. У человека туля­ремия — лихорадочное заболевание с относительно доброкаче­ственным течением, не представляющее опасности заражения для окружающих. Летальность при туляремии в России ниже 0,5% (без лечения). Для диагностики туляремии у больного вполне достаточно применения 2 реакций, кожной пробы и ре­акции агглютинации. Другие иммунологические реакции тех­нически более сложны (например, реакция связывания ком­племента).

Выделение от больного культуры возбудителя доступно лишь специально оснащенным лабораториям и применяется в основном с исследовательскими целями. Для обнаружения туля-ремийных бактерий в органах животных и объектах внешней среды в лабораторной практике чаще всего используют бакте­риологические методы исследования материала. Грызунов, кро­вососущих членистоногих доставляют в лабораторию для иссле­дования с соблюдением предосторожностей, предусмотренных правилами работы с особо опасными инфекциями.

Бактериологический метод для диагностики заболевания у че­ловека по сравнению с биологическим методом малоэффекти­вен, так как в организме больного человека туляремийные микробы содержатся в скудном количестве. Для выращивания туляремийных бактерий используют специальные среды, так как на простых питательных средах (мясо-пептонном агаре, бульоне) этот микроб не растет, обычно применяется сверну­тая желточная среда, рыбно-глюкозо-цистиновый агар и агар с добавлением крови. При массивном обсеменении органов рост культуры туляремийных бактерий появляется через 18—24 ч в виде нежного синего налета на поверхности среды.

2. Бактериоскопия: ввиду очень мелких размеров туляремийного микроба он может быть с достоверностью обнаружен в мазках-отпечатках из патологического материала только при обильном обсеменении последнего. При изготовлении мазков-отпечатков используют окраску по Романовскому-Гимзе. Путем бактерио­скопии (в сочетании с реакцией преципитации) может быть получен быстрый (через 2—3 ч) положительный ответ при ис­следовании доставленных грызунов. Однако он является лишь предварительным, так как положительные результаты бакте-риоскопического исследования должны быть подтверждены выделением культуры.

3. Серологические исследования: из серологических методов иссле­дования применяют реакцию агглютинации по общепринятой методике с использованием туляремийного диагноста. Диагно­стическим считается титр 1: 100 и выше. Более чувствительной является реакция непрямой гемагглютинации, применяемая как для ранней, так и для ретроспективной диагностики. В ка­честве антигена используют туляремийный эритроцитарный диагностикум.

Ускоренный метод серологической диагностики туляремии. Для той цели применяют кровяно-капельную реакцию на стекле. В качестве антигена используют обычный туляремийный диагностикум. В положительных случаях при наличии у больного титра сыворотки 1: 100 и выше агглютинация на стекле насту­пает немедленно после смешения крови с антигеном. Для ускоренной диагностики туляремии у людей может быть использована также микросерореакция. Для ее постановки на предметное стекло наносят не каплю крови, а каплю сыворот­ки крови обследуемого больного и к ней добавляют столько же антигена. Положительная микрореакция на стекле может слу­жить для предварительной ориентации в диагнозе.

4. Аллергическая реакция строго специфична, у больных туляреми­ей людей она становится положительной при всех химических формах туляремии и, как правило, опережает реакцию агглю­тинации. Проба состоит во введении внутрикожно в область предплечья, передней поверхности 0,1 мл тулярина (взвесь убитых туляремийных микробов). Оценку пробы производят через 24, 48 и 72 ч. Проба является положительной при появ­лении отека или инфильтрата. Гиперемия без отека, исчезающая через сутки, диагностического значения не имеет. Внутрикож-ную пробу применяют и для ретроспективной диагностики ту­ляремии. Надо иметь в виду, что проба с тулярином бывает положительной у лиц, подвергшихся прививкам туляремийной вакциной. Вместо внутрикожной пробы пользуются накожной пробой: нанесением двух капель антигена на ладонную по­верхность предплечья с последующими поверхностными на­сечками и легким втиранием антигена. В положительных случаях через 24—36 ч появляются гиперемия и отечность, сохраняю­щиеся 2—3 дня.

5. Биологический метод является самым чувствительным способом обнаружения туляремийных бактерий в любом исследуемом ма­териале. Биологический метод исследования заключается в за­ражении лабораторных животных (морская свинка, белая мышь) результатом бубонов, взятым до 14—20-го дня болезни; соскобом со дна язвы, смешанным с физиологическим раство­ром, полученным до 8—12-го дня, отделяемым конъюнктивы, взятым до 15—17-го дня болезни; кровью 5—6 мл, взятой до 6-го дня болезни. Исследуемый материал вводят подопытным животным подкожно или внугрибрюшно. Зараженные живот­ные погибают от туляремии в течение 4—14 дней. Кусочки пе­чени, селезенки, лимфатического узла и кровь засевают на желточную среду для выделения возбудителя.

Вопрос 68. Стафилококковые инфекции наружных покровов

1. Биология, культуральные свойства стафилококков

2. Антигенное строение; серотины; фаготипы

3. Лабораторная диагностика стафилококковых инфекций

1.филококки широко распространены в природе и являются возбудителями многих заболеваний человека и животных, весьма различных по своим проявлениям, от легких местных фолли­кулитов до стафилококкового сепсиса. Наиболее часто стафи­лококковые заболевания возникают у рожениц и новорожденных в родильных домах (сепсис, маститы, пиодермия и пневмония у новорожденных). Большинство заболеваний стафилококко­вой этиологии возникают в результате заражения патогенными стафилококками, устойчивыми к антибиотикам.

Биология стафилококков, культуральные свойства: для выра­щивания, избирательного выделения и дифференцирования стафилококков существует ряд сред. Корреляцию между био­химическими и культуральными свойствами стафилококков и их патогенностью можно установить при выращивании на сре­де, содержащей водный 1,5%-ный агар, хлористый натрий, магний, дрожжевой экстракт, желатин, двузамещенный фос­форнокислый калий.

Биохимические свойства: стафилококки ферментируют лактозу и маннит, поэтому исследуемый материал засевают на плотные или жидкие среды (агар) с добавлением лактозы и маннита. Патогенные стафилококки при выращивании при 37 "С в те­чение 18 ч разлагают углеводы, и индикатор изменяет цвет среды. Однако значительное число штаммов непатогенных стафилококков (от 11 до 55%) также способно ферментировать маннит, что не позволяет признать эту пробу достаточным критерием патогенности. Кроме того, в связи с выделением штаммов стафилококков, резистентных к действию антибиоти­ков, их способность ферментировать маннит значительно из­менилась.

Существует ряд других методик идентификации и дифференци­рования стафилококков. Нахождение фосфатазы в культурах на чашках с питательной средой рекомендовано для исключения евирулентных штаммов, в частности культур, выделяемых из носа от возможных носителей патогенных стафилококков. Для этой цели применяют агаровую среду, включающую фенолфталеиндифосфат. Микробы, продуцирующие фосфатазу, ос­вобождают свободный фенолфталеин, который затем обнару­живается при помещении чашки с культурой в пары аммония.

Образование токсинов. Связь гемолитической способности стафилококка с его патогенностью позволяет считать гемолиз достаточным критерием патогенности. Для практических целей имеет значение определение гемолитической функции стафи­лококковых L- и В-токсинов. При посеве патогенных штаммов стафилококков, выделяющих А-гемолизин при выращивании при 37 °С на чашках с агаром, содержащих эритроциты барана, вокруг колоний обнаруживают значительные зоны гемолиза, В-гемолизин лизирует эритроциты барана, но при условии, что после выращивания при 37 °С посевы будут помещены на 24 ч щ холод. В связи с указанным свойством В-гемолизин полу­чил название тепло-холодового гемолизина.

2. Патогенные и непатогенные стафилококки могут быть также дифференцированы с помощью реакции адсорбции. С помощью адсорбированных сывороток пиогенные стафилококки были разделены на 7 специфических типов и 8 типов с менее спе­цифическими реакциями. Большое значение имеет метод фаго-типажа стафилококков. С помощью специфических стафило­кокковых фагов стафилококки отнесены к различным фаготипам.

Метод фаготипирования позволяет выявить патогенность штаммов стафилококка. Для фагодиагностики стафилококков с помощью специфического фага применяются фаги, принад­лежащие к 5 группам. Основными фагами удается пикетиро­вать до 60% выделяемых бактерий, процент пикетируемых фа­гами стафилококков достигает 73,7%.

По степени патогенности и токсичности стафилококки могут быть разделены на 3 группы:

• стафилококки 1-й группы дают значительный гемолиз на 5%-ном кровяном агаре с кровью кролика и барана в течение 1—2 ч. Стафилококков этой группы выделяют при фурункулезе, гид-раденитах, остеомиелитах, флегмонах, сепсисе и при ряде дру­гих гнойных заболеваний. Стафилококки, принадлежащие к первой группе, считаются патогенными;

• стафилококки 2-й группы вызывают незначительный гемолиз на 5%-ном кровяном агаре с кровью кролика и барана. Счита­ются условно патогенными. Встречаются часто на открытых по­верхностях кожи, при фолликулитах, иногда на поверхности ран;

• стафилококки 3-й группы не вызывают гемолиза на 5%-ном кровяном агаре с кровью кролика или барана. Эти стафило­кокки следует считать сапрофитами, их часто выделяют с по­верхности здоровой кожи, а также с различных предметов.

3. Стафилококки относительно легко выделяются из очагов пора­жения у человека, и нет необходимости прибегать к методу обо­гащения.

При стафилококковой пневмонии стафилококки чаще всего выделяются в чистой культуре. Для выделения стафилококков производят посев на чашку Петри с молочно-солевым агаром. Одновременно засевают чашки с 5%-ном кровяным агаром с кровью кролика или барана. Через 18—20 ч инкубации при 37 °С выросшие на чашках колонии микроскопируют, делают мазок и окрашивают по Граму. Колонии стафилококков затем пересевают на пробирки с питательной средой и помещают в термостат при 37 "С. Через 12—18 ч роста после микроскопи-рования мазков из выросшей культуры, окрашенных по Граму, ставят реакцию плазмокоагуляции, а из оставшейся культуры готовят взвесь и вводят кролику внутрикожно. Реакцию учиты­вают через 24—48 ч (появление некроза).

Вопрос 69. Возбудитель рожи

/. Свойства возбудителя рожи