Метод каріотипування

Дозволяє вивчити каріотип в цілому (тобто кількість і структуру хромосом). Хромосоми людини вивчають на стадіях метафази і прометафази мітозу.

1) Вивчення метафазних хромосом. Препарат метафазних хромосом однієї клітини називається метафазною пластинкою. Для діагностики більшості хромосомних хвороб метафазні пластинки виготовляють з лімфоцитів периферичної крові. Придатні також фібробласти шкіри, клітини червоного кісткового мозку. Для пренатальної діагностики культивують клітини амніотичної рідини, ворсин хоріона, плаценти, ембріональні тканини. Використовують також клітини різних тканин абортованих ембріонів.

Метафазні пластинки з лімфоцитів периферичної крові одержують таким чином.

Для каріотипування використовують венозну кров (1–2 мл). Кров вміщують в спеціальне живильне середовище (Середовище 199, „Ігла” та ін.) з фітогемагглютиніном (ФГА). ФГА (білок бобових рослин) спричинює імунологічну трансформацію лейкоцитів і їхній поділ шляхом мітозу. Культуру вміщують в термостат на 48–72 год.

За 2–3 год до кінця культивування додають колхіцин (або колцемід). Колхіцин одержують з рослини безвременника осіннього (Colchicum autumnale). Він руйнує веретено поділу і зупиняє поділ клітини на стадії метафази.

Наступний етап виготовлення препарату — обробка клітин гіпотонічним розчином хлориду калію або цитрату натрію. У гіпотонічному розчині клітини набухають, міжхромосомні зв’язки рвуться і хромосоми вільно плавають в цитоплазмі. Клітинну суспензію фіксують і наносять на предметне скло. При висиханні фіксатора клітини і хромосоми міцно прикріпляються до скла.

Препарат забарвлюють ядерними барвниками. Розрізняють методи рутинного і диференціального забарвлення. При рутинному забарвленні препарат забарвлюють азур-еозином за Романовським — Гімзе. При цьому всі хромосоми забарвлюються рівномірно за всією довжиною. Рутинне забарвлення дозволяє підрахувати кількість хромосом, розподілити їх по групах і виявити грубі хромосомні аберації. Для детальної характеристики хромосомних аберацій використовуються різні способи диференціального фарбування.

Вперше методику диференціального забарвлення хромосом запропонував Caspersson в 1968 р. Сьогодні використовують чотири основні методи диференціальних забарвлень: G-, R-, Q-, C-забарвлення.

1. Найбільш широко використовують G-забарвлення (від англ. Giemsa stain). Хромосоми перед забарвленням за Романовським — Гімзе заздалегідь обробляють протеазами (трипсином). Хромосоми після забарвлення стають смугастими. В них чергуються темні і світлі смуги. Поперечні смужки, що виявляються при диференціальному забарвленні, називаються сегментами. Зважають, що темні смуги (G-смуги) —ділянки гетерохроматину,а світлі (R-смуги) — еухроматинову. Зазвичай в гаплоїдному наборі можна налічити до 400 сегментів. Підраховано, що кожний сегмент містить близько 8 млн п. н. Чергування темних і світлих смуг (сегментів) індивідуальне в кожній парі хромосом. Розроблено форму представлення стилізованого ідеального каріотипу з типовим рисунком смуг на кожній хромосомі. Схематично узагальнення каріотипу з графічним зображенням окремих хромосом набору зі всіма їх структурними характеристиками називається ідіограмою.

2. R-забарвлення (від англ. reverse banding — зворотне забарвлення). Рисунок смуг зберігається, але їх колір змінюється на протилежний порівняно з G-забарвленням. Звідси назва методу reverse banding (зворотне забарвлення).

3. Q-забарвлення (від англ. quinacrine — квінакрин, акрихін, один із флюоресцентних барвників) — історично перший метод, розроблений Касперсоном (Caspersson, 1968). При цьому методі хромосоми забарвлюють флюоресцентними барвниками і вивчають за допомогою люмінесцентного мікроскопа.

4. С-забарвлення (від англ. constitutive heterochromatin — конститутивний гетерохроматин). Препарати обробляють лугами, а потім забарвлюють за Романовським — Гімзе. При цьому добре забарвлюються центромери всіх хромосом, довге плече Y-хромосоми та інші ділянки, багаті на гетерохроматин.

У 1971 р. на Паризькій конференції було порівняно дані, одержані при різних методах диференціального забарвлення. Виявилося, що всі методи виявляють у принципі одні і ті самі структури, але кожен з них специфічний щодо певних хромосомних сегментів.

2) Вивчення прометафазних хромосом (диференціальне забарвлення з високою роздільною здатністю). Сьогодні розроблено методики виготовлення прометафазних пластинок, тобто поділ зупиняють на стадії прометафази, коли хромосоми ще недостатньо конденсовані. Прометафазні хромосоми довші, ніж хромосоми на стадії метафази. При диференціальному забарвленні прометафазних хромосом можна розглянути від 550 до 850 сегментів. При цьому сегменти, спостережувані в метафазних хромосомах, можна підрозділити на субсегменти. Цей метод використовують для діагностики мікроделецій, мікродуплікацій і складних хромосомних аберацій.

Поиск по сайту: