Молекулярно-цитогенетичні методи

Це методи, які поєднують традиційні цитогенетичні методики з молекулярно-генетичними технологіями. Основним є метод флюоресцентної гібридизації in situ (FISH-метод).

Методика містить гібридизацію in situ (тобто в препараті, на предметному склі) забарвлених флюоресцентними барвниками ДНК-зондів з метафазними або інтерфазними хромосомами.

Зонд — це ділянка одноланцюжкової ДНК, комплементарна певній ділянці гена або хромосоми. Зондами можуть служити послідовності ДНК, виділені з геному, штучним чином синтезовані або клоновані за допомогою бактеріальних плазмід або іншими способами. Для FISH-методу зонди мітять біотином або дигоксигеніном, до яких потім приєднуються флюоресцентні барвники.

Метод містить такі етапи:

1. Готують препарат метафазних або прометафазних хромосом.

2. Препарат обробляють лугами. При цьому відбувається денатурація ДНК, тобто розриваються водневі зв’язки між двома ланцюгами ДНК.

3. На скло капають ДНК-зонди. Зонди з’єднується з комплементарними послідовностями ДНК хромосом. Відбувається так звана гібридизація. Гібридизація — це з’єднання за принципом комплементарності нуклеїнових кислот, виділених із різних джерел (в даному випадку відбувається гібридизація ДНК пацієнта з ДНК зонда).

4. Препарат відмивають від надлишку зонда. Гибридизовані зонди залишаються фіксованими на хромосомах. Його обробляють флюоресцентними барвниками, які приєднуються до біотину або дигоксигеніну. Як барвники можуть бути використані родамін (дає червоне світіння) або флюоресцеїн ізотіоціанат (зелене світіння).

5. Препарат вивчають під люмінесцентним мікроскопом. Ділянки хромосом, де відбулася гібридизація і е знаходяться зонди, дають специфічне світіння.

Нині FISH-метод використовують також для вивчення хромосом у клітинах, що не діляться, на стадії інтерфази.

У клінічній генетиці метод використовують для швидкої діагностики хромосомних хвороб, пов’язаних із зміною кількості хромосом в інтерфазних ядрах, а також для діагностики мікроделецій, мікродуплікацій і складних хромосомних перебудов, які за допомогою звичних цитогенетичних методик виявляються рідко.

Розроблено різні типи зондів:

а) Зонди до певного локусу хромосоми (гена).

б) Зонди до теломерів.

в) Набір зондів до різних локусам однієї і тієї ж хромосоми.

г) Зонди до центромерів певних хромосом. Так, синтезовано зонди до центромерів 13, 18, 21, Х і Y хромосом. Їх використовують для швидкої пренатальної діагностики найбільш розповсюджених хромосомних синдромів в інтерфазних клітинах ворсин хоріона або амніотичної рідини.

Поиск по сайту: