АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

Определение колифагов

Читайте также:
  1. A. Определение элементов операций в пользу мира
  2. I. Определение потенциального валового дохода.
  3. II. Определение геометрических размеров двигателя
  4. II.ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТИ ЛА
  5. P.2.3.2.1(с) Определение удельной теплоемкости твердых тел
  6. Б) Определение жёсткости
  7. В) Определение объема движений
  8. В) Определение щёлочности.
  9. Введение в психологию человек. Определение психологии человека как науки. Задачи и место психологии в системе наук.
  10. Виды психологической помощи: определение, структура. Подготовка психолога. Личностные качества психолога
  11. Виды факторов производства и определение прав собственности экономических субъектов
  12. Вопрос Определение и классификация ЧС.

 

Колифаги — бактериальные вирусы (бактериофаги), заражающие Escherichia coli и, в результате, формирующие зоны лизиса (бляшки) бактериальной культуры, засеянной «газоном» на питательном агаре через 18 часов инкубирования при 37 оС.

Титрационный метод определения колифагов. Определение колифагов в питьевой воде включает предварительное накопление колифагов в среде обогащения на культуре E.coli и последующее выявление зон лизиса (просветления) газона E.coli на питательном агаре. Метод предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды.

Проведение качественного анализа. В исследуемую пробу воды объемом 100 см3 вносят питательный бульон и подготовленный смыв тест культуры E.coli, помещают в термостат и инкубируют 18 часов при 37 оС. Затем из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 см3, добавляют хлороформ, пробирку закрывают стерильной резиновой пробкой, встряхивают и оставляют при комнатной температуре до полного осаждения хлороформа. В предварительно расплавленный и остуженный до 45-49 оС питательный агар добавляют приготовленный смыв культуры E.coli. В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 см3 обработанной хлороформом пробы, заливают смесью расплавленного и остуженного до 45-49 оС питательного агара и осторожно покачивают для равномерного перемешивания пробы воды и агара. После застывания чашку переворачивают и инкубируют в термостате 18 часов при 37 оС. Параллельно проводят контроль культуры E.coli.

Учет результатов. Просмотр посевов проводят в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветлении нескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. В протоколе анализа отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 100 см3 воды. При наличии зон лизиса в контроле культуре результат считается недействительным.

Проведение количественного анализа. Исследуемую пробу воды в количестве 100 см3 разделяют на шесть порций: 1 флакон с 50 см3 и 5 пробирок с 10 см3. К 50 см3 пробы добавляют 5 см3 десятикратного питательного бульона и 0,5 см3 смыва E.coli. В каждые 10 см3 пробы вносят по 1 см3 десятикратного питательного бульона и по 0,1 см3 смыва бактерий.

Для контроля культуры 0,1 см3 смыва E.coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром. Посевы инкубируют 18 часов при 37 оС.

Затем из объема 50 см3 отливают в пробирку 10 мл. Во все исследуемые 6 объемов добавляют по 1 см3 хлороформа. Пробирки закрывают резиновыми пробками, энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре для осаждения хлороформа.

В предварительно расплавленный и остуженный до 45-49 оС питательный агар добавляют смыв E.coli. Приготовленную смесь разливают в две чашки Петри: одну чашку для контроля культуры E.coli на лизогенность и одну чашку для исследуемой пробы воды. После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделяют на 6 секторов и маркируют в соответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствующей пробирки наносят пастеровской пипеткой (или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капле надосадочной жидкости. После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку помещают в термостат при 37 оС на 18 часов.

Учет результатов. Просмотр результатов осуществляют в проходящем свете. Учитывают наличие зон просветления (лизиса) на секторах газона E.coli. При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха. Пробу считают положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. Оценку проводят по таблице наиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (БОЕ). В протоколе анализов указывают наиболее вероятное количество колифагов в 100 мл воды в диапазоне возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел – верхний предел) колифагов в 100 см3. Результат полуколичественный. При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считают недействительным.

Прямой метод определения колифагов. Определение колифагов в питьевой воде включает исследование нормируемого объема воды (100 см3) путем его прямого посева и последующего подсчета зон лизиса (бляшек) на газоне E.coli в чашках Петри с питательным агаром. Прямой метод выделения колифагов из воды проводят параллельно с титрационным методом при исследовании по эпидемическим показаниям.

Проведение анализа. В питательный агар, расплавленный и остуженный до 45-49 оС добавляют смыв E.coli и перемешивают. Исследуемые 100 см3 воды разливают по 20 см3 в большие пробирки, нагревают до 35-44 оС и немедленно разливают в 5 чашек Петри. Затем в каждую чашку сразу же вносят по 20 см3 смеси агара с культурой E.coli. Для контроля культуры E.coli в одну чашку Петри вносят 20 см3 стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до 35-44 оС, заливают 20 см3 приготовленного агара с E.coli. Содержимое чашек осторожно перемешивают. Чашки с застывшим агаром помещают вверх дном в термостат и инкубируют в течение 18 часов при 37 оС.

Учет результатов. Просмотр посевов проводят в проходящем свете. Учет результатов осуществляют подсчета и суммирования числа бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 см3 пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.

Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных бляшек (от 1 до 5-7 мм в диаметре) с четко выраженными либо стертыми границами.

При высоких концентрациях фага можно наблюдать «ажурный» газон Е. coli, рост единичных колоний Е. coli на фоне сплошного лизиса, либо полное отсутствие роста на чашке.

Окончательный количественный учет прямого посева проводят через 18 часов. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 см3 пробы воды. Если отмечен сливной рост бляшек и подсчет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: «обнаружено в 100 см3воды». При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.

Норматив: В 100 см3 исследуемой воды должны отсутствовать БОЕ колифагов.

1.2. Выявление Legionella pneumophila в объектах окружающей среды

В настоящее время род Legionella включает около 50 видов бактерий, обитающих в пресноводных водоемах в ассоциациях с сине-зелеными водорослями и в организмах свободноживущих простейших. Большинство видов не представляет опасности для человека.

В воде легионеллы размножаются, что происходит в диапазоне температур, равных 25-45 оС. Условия для размножения легионелл в искусственных водных системах (системы охлаждения и кондиционирования, градирни, компрессорные устройства, джакузи, медицинское оборудование и др.) более благоприятны, чем естественные, что и приводит к накоплению высоких концентраций бактерий. Основной фактор передачи – водный мелкодисперсный аэрозоль, образуемый системами водных коммуникаций.

Болезнь легионеров (острая пневмония с токсическим синдромом) вызывает L. pneumophila. Поражения респираторного тракта также спорадически вызывают L. micdadei и L. bozemanii. Оппортунистические заболевания могут вызывать L.micdadei, L.longbeachae, L.dumoffii и L.bozemanii, особенно при нарушениях клеточного иммунитета. Остальные виды не патогенны для человека.

 

Санитарно-микробиологическому исследованию на обнаружение возбудителя болезни легионеров (L. pneumophila) подлежат в порядке надзора:

1. Системы кондиционирования и вентиляции, водонагревательные и охладительные системы

2. Медицинское оборудование и инструментарий

3. Бассейны

4. Аквапарки

5. Джакузи

6. Фонтаны

Выявление L. pneumophila проводят также в ходе проведения противоэпидемических мероприятий и при эпидемиологическом расследовании вспышек болезни легионеров.

Отбор проб. Пробы воды объемом 0,5-1,0 дм3 отбирают в стерильные емкости. Для дехлорирования воды используют кристаллы гипосульфита натрия.

Поверхностные и глубинные пробы отбирают специальными батометрами.

Смывы с объектов (оборудования для кондиционирования и вентиляции, водонагревательных и охладительных систем, медицинского инструментария) забирают тампоном, смоченным стерильным физиологическим раствором и помещают в ту же пробирку.

Поскольку легионеллы способны к образованию биопленок на синтетической и резиновой поверхности водопроводного, промышленного, лабораторного и иного оборудования, связанного с циркуляцией и хранением воды, биопленки также забирают для исследования. Соскобы влажных биопленок с поверхности, находящейся под водой или на границе воды и воздуха, берут сухими тампонами и помещают во флакон или в пробирку. С высохшей поверхности биопленки забирают тампонами, увлажненными стерильным физиологическим раствором и помещают в пробирку со стерильным физиологическим раствором. Доставку проб осуществляют при температуре 6-24 оС.

Подготовка проб к исследованию. В случае сильной загрязненности образцы воды фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр с помощью стеклянной воронки. Затем воду пропускают через мембранный фильтр, который переносят после фильтрации в стерильный флакон с 10 см3 физиологического раствора. Содержимое флакон 1-2 мин перемешивают на встряхивателе или 10 мин на качалке и затем центрифугируют 30 мин при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют 1 см3 стерильного физиологического раствора и переносят в стерильную пробирку.

Для снижения уровня загрязненности сконцентрированной пробы посторонней микрофлорой одну её часть прогревают 30 мин при 50 оС, а другую обрабатывают кислотным буфером КСl-HCl (рН 2,2) в течение 4 мин.

Образцы биопленок, смывы с поверхностей концентрируют с помощью центрифугирования, кислотной и термической обработок.

Проведение анализа. Концентрированные, обработанные кислотным буфером и прогретые образцы засевают по 0,1 см3 на чашки с буферным угольно-дрожжевым агаром (БУДРАГ) с ростовой и селективной добавкой. Помещают в термостат при 37 оС до 10 дней во влажной атмосфере в присутствии СО2. Исследование посевов начинают с 2 суток. Колонии легионелл на селективной среде имеют вросший центр, зернистую или блестящую поверхность; окрашены в серовато-голубоватый или зеленоватый цвет. Идентифицируют легионеллы по морфологическим, тинкториальным (грамотрицательные палочки), антигенным свойствам (реакция латекс-агглютинации с моновалентными и групповыми сыворотками, иммунофлуоресцентная микроскопия с мечеными антителами), а также идентификацией ДНК бактерий в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Определение количества легионелл в исследуемом материале. Для определения количества легионелл проводят посев исследуемой концентрированной пробы без тепловой и кислотной обработки. Подсчитывают число колоний легионелл, выросших на чашке. Количество легионелл определяют по формуле

 

Х = c а х b s х 1000см3

 

где

Х — количество легионелл на литр в исследуемой пробе

a — количество колоний легионелл, выросших на чашке

b — объем концентрата пробы (по завершении этапов фильтрации и центрифугирования) в см3

c — объем, высеянный на чашку, в см3мл

s — объем исходной пробы в дм3

Рекомендуемые значения для оценки уровня контаминации Legionella pneumophila объектов окружающей среды.

1. Присутствие L. pneumophila в воде различных объектов окружающей среды, воде бассейнов, аквапарков, джакуззи, систем кондиционирования воздуха и др. в концентрации менее 1 х 102 микробных клеток на дм3 является допустимым и не требует проведения профилактических мероприятий.

2. Концентрация легионелл в диапазоне от 1 х 102 до 9 х 103 микробных клеток на дм3 не представляет эпидемической опасности, но требует ежемесячного микробиологического контроля и проведения профилактических мероприятий.

3. При обнаружении легионелл в концентрации 1 х 104 микробных клеток на дм3 и выше делают вывод о колонизации данного объекта легионеллами в концентрации, представляющей эпидемическую опасность и требующей дезинфекционных и профилактических мероприятий.

 


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |

Поиск по сайту:



Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.005 сек.)