Изготовления мазков и методы их окраски

Бактериоскопическое исследование клинического материала, в котором находятся возбудители инфекционных болезней, является одной из самых распространенных микробиологических методик. В лабораторной практике чаще проводят микроскопию фиксированных окрашенных мазков и реже нативных препаратов в виде раздавленной и висячей капель. Их изготовляют на предварительно подготовленном и оснащенном рабочем месте.

На столе должны быть лишь необходимые материалы, инструменты и устройства: клинический материал (кровь, гной, слизь, мокрота, моча, испражнения и др.), культуры микроорганизмов в пробирках или чашках Петри, бактериологические петли, пипетки, пинцеты, штативы, предметные стекла, газовая горелка, изотонический раствор хлорида натрия, растворы красителей, лотки с рейками для окрашивания мазков, промывалка с водой, фильтровальная бумага, банка с дезраствором для обеззараживания использованных препаратов и пипеток. Целесообразно в лаборатории оборудовать отдельный столик для окраски мазков.

Мазки препаратов готовятна предметных стеклах, толщина которых из-за оптических свойств конденсора Аббе не должна превышать 1-1,2 мм. Стекла необходимо предварительно тщательным образом обезжирить. Для этого в течение суток их выдерживают в концентрированной серной кислоте или кипятять в смеси 6 % раствора двухромового калия и серной кислоты, тщательным образом промывают проточной водой, переносят в банку с 96° спиртом, где они хранят к употреблению. Можно обезжиренные и выдержанные в спирте стекла вытереть досуха льняной тканью и хранить в герметически закрытой стеклянной банке. Капля воды, нанесенная на холодное обезжиренное стекло, должна равномерно растекаться, а не собираться в мелкие капельки.

Изготовление мазков препаратов из плотного (густого) клинического материала или из культуры на твердой среде. Обезжиренное предметное стекло проводят через пламя газовой горелки и после охлаждения кладут на рабочее место. Для изготовления мазка материал или культуру берут бактериологической петлей из платинового или хромо-никелевого провода длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе. Конец ее сгибают в виде замкнутого кольца размером 1х1,5 м или 2х3 мм Для некоторых работ нужно иметь этот инструмент в виде иглы, когда конец не сгибают в кольцо, а оставляют прямым.

Video

Бактериологическую петлю прожаривают в пламени, держа ее как карандаш вертикально в правой руке. Два-три раза проводят через пламя и третью часть петледержателя. Не выпуская петли, левой рукой берут пробирку с 0,9 % стерильным раствором хлорида натрия а 4-м и 5-м пальцами правой руки зажимають ватно-марлевую пробку, вынимают ее, и верх пробирки проносят через пламя горелки. Держат на расстоянии 15-20 см от пламени, не выпуская пробки. Петлю вводят в пробирку и охлаждают ее, касаясь стенки. Окуная петлю в жидкость, набирают каплю физраствора. Вынимают петлю, проводят пробку и открытый возле пробирки через пламя, после чего ее закрывают и ставят в штатив. На центр стеклышка бактериологической петлей наносят взятую каплю изотонического раствора.

Петлю опять стерилизуют, в левую руку берут пробирку с исследуемым материалом или культурой микроорганизмов. Открывают пробирку с соблюдением всех правил, охлаждают петлю и набирают ею небольшое количество материала или культуры. Петлю вынимают, а пробирку закрывают и ставят в штатив. Взятый материал (или культуру) наносят на стекло возле капли физраствора и, постепенно растирая его и эмульгируя в капле, готовят тонкий, равномерный мазок округлой или овальной формы диаметром 1-1,5 см. После этого петлю прожаривают и ставят в штатив.

Изготовление мазков из жидкого клинического материала или из культуры на жидкой среде. Бактериологической петлей набирают каплю исследуемого материала или культуры из жидкой среды с соблюдением правил стерильности, как описано выше. Взятый материал наносят на предметное стекло и делают равномерный тонкий мазок.

Если для забора материала используют стерильную пастеровскую пипетку, ее также держат в правой руке и проводят через пламя перед внесением в пробирку. Тонкий кончик пипетки после охлаждения возле стенки пробирки окунают в жидкий исследуемый материал или бульйонну культуру, держа верхний конец ее открытым. После попадания в пипетку исследуемого материала или культуры верхний конец ее закрывают указательным пальцем, вынимают из пробирки. Последнюю закрывают и ставят в штатив. На поверхность предметного стекла из пипетки выпускают каплю материала и опускают ее в дезраствор. Простерилизованой бактериологической петлей делают мазок.

Video

Изготовление мазков измокроты или гноя. При приготовлении мазков из материалов, которые плохо растираются (гной, мокрота), используют два предметных стекла. Небольшое количество материала стерильной бактериологической петлей или пастеровской пипеткой наносят на середину обезжиренного предметного стекла и покрывают его вторым стеклом так, чтобы 1/3 верхнего и нижнего стекла оставалась свободной. Оба стекла сильно зажимают между пальцами, раздавливают исследуемый материал и за свободные концы разводят их в стороны. Таким способом получают два одинаковых мазка.

Video

Изготовление мазков из крови. Стерильной иглой делают прокол щепотки 4-го пальца левой руки. После появления капли крови к ней касаются поверхностью возле края обезжиренного стерильного предметного стекла, которое быстро кладут на стол. Краем другого немного более узкого и шлифованого стекла касаются капли и наклонив его под углом 45° быстро и осторожно проводят им по направлению к дальнейшему краю. В результате капиллярности кровь захватывается краем верхнего стекла и во время движения размазывается по нижнему стеклу. Правильно изготовленный препарат выходит тонким, несколько просвечивает и имеет желтоватую расцветку.

Из крови изготовляют также препарат "толстой капли". На предметное стекло наносят раздельно 2-3 обычных капли крови, слегка смешивают их стеклянной палочкой, петлей или углом другого предметного стекла так, чтобы образовалось плоское кровяное пятно диаметром около 1,5 см. Такие препараты готовят в частности при диагностике малярии, возвратных тифов.

Отпечатки мазков делают из органов трупов людей и животных, пищевых продуктов плотной консистенции (сыр, мясо, ветчина, колбаса, рыба и др.), а также из поверхности молодых колоний грибов, актиномицетов, реже бактерий. Накаленным в пламени скальпелем прижигают поверхность органа или пищевого продукта. Потом стерильными ножницами из этого участка вырезают кусочек ткани. Поверхностью среза касаются предметного стекла в 2-4 местах, делая отпечаток мазка. Такие же отпечатки мазков можно изготовить из участка кожи или слизевой оболочки. Прижимание исследуемого обьекта к стеклу должно быть строго вертикальным длительностью 1-2 с. Отпечатки мазков из колоний делают на покровных стеклах.

Высушивание и фиксация мазков препаратов. Изготовленные мазки высушивают при комнатной температуре или в термостате. Тонкие мазки быстро высыхают на воздухе, более толстые можно высушивать над пламенем газовой горелки. Предметное стекло при этом держат за ребра 1-м и 2-м пальцами правой руки мазком кверху. Чтобы не допустить денатурации белков бактерий и нарушения их внутренней структуры степень нагревания контролируют средним пальцем, который находится под предметным стеклом.

Высушенные препараты необходимо фиксировать к поверхности стекла. Незафиксированный мазок является заразным, потому при работе с ним нужно быть очень осторожным, не касаться к нему руками. При фиксации одновременно происходит прикрепление бактерий к стеклу и их обеззараживанию. К тому же убитые микроорганизмы значительно лучше окрашиваются.

В лабораторной практике самым распространенным методом фиксации мазков является фламбирование  то есть фиксация в пламени газовой горелки или спиртовки. При этом мазок держат так же, как при высушивании и трижды проводят его через пламя. Весь процесс фиксации длится 5-6 с, а действие температуры 2 с. Более длительная фиксация уменьшает качества препарата, а недофиксированный мазок при следующей обработке смывается и таит в себе опасность заражения.

При изучении некоторых структур микробных клеток, а также мазков крови, отпечатков органов используют такие фиксирующие жидкости в качестве этанола (на протяжении 10-15 мин), метанола (5 мин), ацетона (5 мин), смеси Никифорова (10-15 мин), пары формалина или осмиевой кислоты (несколько секунд). При такой осторожной фиксации значительно лучше сохраняются и просмотриваются все структуры клеток и бактерий.

Окраска мазков препаратов. Морфологию бактерий изучают, как правило, на зафиксированных и окрашенных препаратах. Неокрашенные микроорганизмы, за исключением грибов, плохо видимые в световом микроскопе из-за их малой контрастности. Для окрашивания мазков в бактериологических лабораториях широко употребляют анилиновые красители. Они разделяются на кислые, нейтральные и основные. Последние хорошо окрашивают как ядерный аппарат, так и цитоплазматические структуры. Положительно заряженная красящая часть их молекулы быстрее и полнее вступает в соединение с отрицательно заряженной бактериальной клеткой. Кислые же красители красят микробы значительно слабее. Способность и индивидуальная особенность бактерий окрашиваться теми или иными красителями называются их тинкториальными свойствами.

В повседневной лабораторной практике чаще всего употребляют такие красители: красные  фуксин основной (диамантфуксин, солянокислый розанилин или парарозанилин), фуксин кислый, нейтральный красный, сафранин, конго красный; фиолетовые  генциан-, кристал- и метил-виолет; синие  метиленовый и толуидиновый синий, трипановый голубой; зеленые  малахитовый, брильянтовий зеленый; желто-коричневые  везувин, хризоидин и др.

Основные виды красителей, которые применяются в микробиологической практике:

Для окрашивания мазков необходимо иметь набор красящих растворов в флаконах с пипетками и резиновыми баллончиками. Их удобно размещать в деревяном штативе (колодке с гнездами). Смывы красителей и прополаскивание препаратов делают с помощью специальных устройств.

Предложенные многочисленные методы окраски бактерий. Они разделяются на простые и сложные.

Поиск по сайту: