Основные солевые, диспегрирующие растворы и питательные среды, необходимые для культивирования клеток, и их компоненты

Солевые растворы. Для приготовления питательных сред применяют физиологические солевые растворы, функция которых заключается в сохранении рН, осмотического давления среды и в обеспечении клеток необходимыми неорганическими веществами. Растворы готовят из химически чистых солей на высокоочищенной воде, свободной от ионов тяжелых металлов, токсичных для клеток. Используют дистиллированную воду, дважды перегнанную в стеклянных аппаратах, или воду, полученную в ионообменных колонках, нейтральной реакции. Воду получают в день приготовления растворов или накануне и хранят в стерильном стеклянном сосуде под резиновой пробкой на холоде. Предложены различные Прописи сбалансированных солевых растворов, но наиболее часто употребляют из-за простоты получения растворы Хенкса и Эрла. Для приготовления каждого раствора вначале готовят 10-кратные концентраты всех компонентов (основной раствор). Для этого в градуированную бутыль емкостью 1 л наливают 700—800 мл бидистиллированной воды и растворяют последовательно (во избежание образования труднорастворимых осадков) следующие химически чистые соли (в граммах). Основной раствор Хенкса; Основной раствор Эрла. Состав: NaCl, глюкоза, KCl, MgCl, CaCl2, глюкоза, феноловый красный и др. Питательная среда для культивирования клеток должна иметь солевой состав, близкий к таковому животного организма, определенную концентрацию водородных ионов (рН), быть изотоничной и содержать необходимые для жизнедеятельности клеток питательные вещества: аминокислоты, углеводы, витамины и факторы роста.

Питательные среды. Нормальный рост и размножение клеток вне организма могут происходить как в естественных, так и в искусственных, синтетических питательных средах, обогащенных стимулирующими биологическими жидкостями, такими, как сыворотка крови, эмбриональный экстракт и др. Среды, обеспечивающие активное размножение клеток, называют ростовыми средами, а синтетические среды, не содержащие естественных стимулирующих продуктов или содержащие их в минимальном количестве, способные в основном только поддерживать жизнеспособность, переживание клеток, называют поддерживающими средами.

Естественные питательные среды являются наиболее дешевыми и полноценными для культивирования клеток. Их приготовляют из сыворотки человека или животных, эмбрионального экстракта, амниотической жидкости и сбалансированных солевых растворов в различных соотношениях и используют для выращивания вновь изолированных и очень прихотливых клеток. Сыворотка является важнейшей составной частью всех питательных ростовых сред. Для культивирования клеток наиболее часто используют сыворотку человека, коров, лошадей, реже — овец, кроликов и кур. Используют также сыворотку плацентарной крови человека. Сыворотку проверяют на стерильность, при необходимости фильтруют и применяют инактивированной прогреванием (при 56° 30 минут) или непрогретой. Сыворотку хранят в ампулах или пробирках под резиновыми пробками при температуре 2—4°, а в случае длительного хранения, учитывая нестабильность глютамина, замораживают при —15—20°. Некоторые индивидуальные сыворотки оказываются токсичными, вызывают склеивание, дегенерацию клеток и непригодны для их культивирования. Поэтому каждую свежеполученную сыворотку следует проверять на токсичность путем внесения в культуры клеток параллельно с добавлением в контрольные культуры известной нетоксичной сыворотки. Токсичность сыворотки может быть ослаблена смешиванием нескольких индивидуальных сывороток. Сыворотка плацентарной крови не обладает токсическим действием. Используют эти среды редко.Для культивирования клеток используют также ферментативные гидролизаты белковых веществ: лактальбумина, казеина и белка крови крупного рогатого скота или человека (отходы производства гамма-глобулина).

Наиболее широкое применение получил ферментативный гидролизат лактальбумина, содержащий все незаменимые аминокислоты и витамины. Это так называемые полусинтетические питательные среды. Ферментативный гидролизат белков цельной крови крупного рогатого скота выпускается под названием «аминопептид-2». Аминопептид-2 содержит все незаменимые аминокислоты и в качестве их источника вводится в питательные среды для культивирования клеток.

Синтетические питательные среды. Преимуществом синтетических питательных сред является их строго определенный состав, что позволяет стандартизовать условия эксперимента. В настоящее время разработаны прописи ряда синтетических питательных сред (199, 703, 858, среда Игла и др.), содержащих аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли и некоторые другие вещества, необходимые для поддержания жизнедеятельности клеток вне организма. Однако для выращивания полноценных культур клеток ко всем предложенным синтетическим средам необходимо добавлять сыворотку. Для культивирования клеток широко применяется среда 199, предложенная Morgan, Morton и Parker. Приготовление среды довольно сложное. Она может быть приобретена в готовом виде. Для выращивания клеток среду 199 используют с добавлением 5—10% коровьей или лошадиной сыворотки, а для поддержания зараженных вирусами культур клеток - без сыворотки или с добавлением 2% ее. Срок годности среды при хранении в холодильнике 1 год.

Диспергирующие растворы. Раствортрипсина применяют для получения клеточной взвеси из органов и тканей и снятия клеток с поверхности стекла. Раствор готовят следующим образом. В 500 мл бидистиллированной воды растворяют 2,5 г трипсина. Отдельно готовят солевой раствор следующего состава.

NaCI 8,0г; КСI 0,2 г; MgCl2*6H20 0,1 г; Na2HP04*2H20 1,42 г; КН2Р04 0,2 г; Пенициллин 100 000 ЕД; Стрептомицин 100 000 мкг; Вода бидистиллированная 500 мл;

Полученные растворы смешивают, фильтруют через ватномарлевый фильтр и стерилизуют фильтрованием. Перед фильтрацией пластины фильтра промывают стерильной бидистиллированной водой. Первую порцию профильтрованного трипсина не используют ввиду ее малой активности. Срок годности трипсина при хранении в холодильнике 2 месяца, а в замороженном состоянии при —20° 3 месяца. При длительном хранении диспергирующая активность трипсина снижается, что отрицательно влияет на качество получаемых клеток.

Растворверсена (Натривая саль этилендиаминтетрауксусная кислоты) применяют для снятия клеток с поверхности стекла. Он вызывает более тонкое диспергирование клеток и в меньшей степени влияет на их жизнеспособность, чем раствор трипсина. Для приготовления раствора версена ингредиенты растворяют в следующем порядке.

NaCl 8,0 КС1 0,2 NaHP04 1,15 или Na2HPO4*2H20 1,45 или Na2HP04*12H20 2,9 Версен (натриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты) 0,2 Вода бидистиллированная до 1000 мл

Перемешивают, фильтруют, стерилизуют. Срок годности 1 год

Поиск по сайту: