Генетические методы диагностики вирусных болезней животных (ПЦР), использование в вирусологии

Наиболее широкое распространение во всем мире получил метод ПЦР. Она была предложена в 1986 году американским биохимиком Мюллисом. Мюллис стал лауреатом государственной премии.

Для вирусологической диагностики этот метод стал одним из главных. ПЦР позволяет выявить в исследуемом патматериале наличие специфического участка ДНК или РНК, характерного для исследуемого организма и многократно разможить его – амплифицировать. Амплификация – изолированное размножение гена или его фрагментов.

Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации нуклеиновой кислоты, включающем расплетение двойной спирали, расхождение нитей, комплементарное достраивание обеих нитей. Механизм репликации таков, что комплементарное достраивание нитей может начаться не в любой точке последовательности ДНК, а только в определенных стартовых блоках, коротких двунитчатых участках. Маркировав такими блоками специфический участок ДНК добиваются протекания синтеза только в этом участке, а не по всей длине нити ДНК (РНК). В результате происходит увеличение количества копий специфического фрагмента по формуле 2ⁿ, где n – число циклов аплификации. Для создания стартовых блоков в заданных участках ДНК (РНК) используют две олигонуклеотидные генетические затравки, которые иначе называются праймерами. Праймеры – искусственно синтезируемые одноцепочечные дезоксиолигонуклеотиды, состоящие из 20-30 АО. Они представляют собой концевые последовательности интересующего фрагмента ДНК. При температуре 72 градуса протекает синтез полинуклеотидных цепей путем удлинения праймиеров с помощью дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Праймеры или ампликоны накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать (преобладать) среди продуктов амплификации. В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицированного участка. Процесс является цепным, так как синтезированные фрагменты ДНК в дальнейшем сами служат матрицей, на которой идет синтез. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границе специфического фрагмента. Они ориентированы таким образом, что синтез протекает между ними, удваивая количество копий этого фрагмента, пофторяет стадии амплификации примерно 30-40 раз. За 1,5-3 часа получают миллионы копий специфического участка ДНК или РНК вируса для обнаружения её с помощью электрофареза.

Этапы:

1. Выделение ДНК. Готовят суспензию, обрабатывают, очищают.

2. Собственно амплификация. При этом изменяют температурный режим, и процесс идет стадийно

1) Плавление ДНК – 92 градуса – расплетение нитей

2) Отжиг праймеров

3) Достройка комплементарных цепей

3. Детекция. Учет результатов. Получение окончательного результата проводят с помощью электрофареза, результаты – на мониторе компьютера. Всегда сравнивают полученный результат сравнивают с контрольными положительными и отрицательными контрольными образцами. Выявляют продукт амплификации с помощью ДНК-зондов.

В настоящее время разработаны отечественные тест-системы для диагностики методом ПЦР таких заболеваний, как лейкоз, чума КРС. Бешенство, ящур. Классическая чума свиней, африканская чума свиней, трансмиссивный гастроэнтерит, везикулярная болезнь свиней, парвавирусная инфекция свиней, ССЯ, болезнь Марека, инфекционный бронхит кур, Нью-касслская болезнь, ринотрахеит кошек и др.

Преимущества: высокая чувствительность, достаточно 10 вирусных частиц; высокая специфичность; быстрота получения результата

Разработан метод ПЦР в реальном времени. Регистриты можно регистрировать в любой момент времени при прохождении этой реакции. Для выявления продуктов амплификации используют флюоресцентные ДНК-зонды. К зонду присоединены 2 химических соединения – флюоресцентная метка и гаситель флюоресценции. В ходе ПЦР происходит разъединение флюоресцентной метки и гасителя. Это приводит к появлению свечения. Регистрируя интенсивность свечения можно узнать о ходе реакции.

Поиск по сайту: