А. Механические методы

Они основаны на механическом разъединении одной бактериальной клетки от другой с целью получения отдельных изолированных колоний на плотной питательной среде. После культивирования посевов в термостате из отдельной нужной колонии делается пересев на питательную среду, в которой вырастают чистые культуры бактерий.

1-й день исследования

Из исследуемого материала готовят мазки и окрашивают их по Граму. При микроскопии устанавливают наличие бактерий, их морфологические особенности и отношение к окраске по Граму.

Для получения изолированных колоний исследуемый материал высевают на поверхность плотной питательной среды в чашках Петри.

Агар в чашки разливают следующим образом: флакон со стерильной питательной средой помещают в водяную баню. После расплавления агара и его охлаждения до 42°С флакон берут в правую руку, левой рукой извлекают пробку, обжигают горлышко флакона, большим и указательным пальцами левой руки слегка приподнимают крышку чашки. Вводят горлышко флакона под крышку чашки (не касаясь краев), наливают 15-20 мл питательного агара, быстро выводят горлышко флакона и закрывают чашку крышкой. Края горлышка флакона подводят к пламени и закрывают его обожженой пробкой. Слегка покачивая круговыми движениями чашку, достигают равномерного распределения среды. Чашки оставляют на месте, пока среда не застынет, а затем их переносят в термостат, поворачивая вверх дном, снимают крышку и оставляют в таком виде на 15-20 минут для подсушивания.

Существует несколько методов посева материала для выделения чистой культуры бактерий. Посев на чашки штрихом производится при помощи петли, которой набирают небольшое количество исследуемого материала и, не вынимая петлю из пробирки, стряхивают излишнее его количество. Чашку с питательной средой помещают на столе вверх дном. Левой рукой берут дно чашки, держа ее почти вертикально, и густо заштриховывают петлей небольшой участок агара в верхней части чашки. Петлю следует держать свободно большим и указательным пальцами правой руки, ближе к концу петледержателя. Освободив таким образом петлю от излишнего материала, легкими движениями, не повреждая поверхности среды, наносят, отрывая друг от друга, параллельные штрихи на расстоянии около 0,5 см.

В отдельных случаях можно производить последовательный рассев материала, используя для этого несколько чашек с питательной средой. Набрав петлей материал, производят посев штрихами на первой чашке и той же петлей, не набирая материала, вновь наносят штрихи на вторую и третью чашки с питательным агаром. На первой чашке обычно получают рост в виде сплошных штрихов, на второй и, особенно на третьей бактерии развиваются в виде изолированных колоний (рис. 27).

Рис. 27. Рост бактерий на плотной питательной среде при последовательном посеве

Посев шпателем. Посев исследуемого материала нередко производят шпателем, который заранее заворачивают в бумагу и стерилизуют горячим воздухом. Исследуемый материал в количестве одной петли или капли наносится пастеровской пипеткой в центр чашки со средой, каплю шпателем распределяют на небольшом участке среды, а затем круговыми движениями по всей ее поверхности. На время посева крышка чашки, поддерживаемая левой рукой, остается слегка открытой.

Шпатель из первой чашки быстро переносят во вторую чашку, а затем в третью. По окончании посева шпатель погружают в банку с дезинфицирующим раствором. Чашку с соответствующей надписью на дне помещают в термостат вверх дном для того, чтобы конденсационная вода, скапливающаяся на внутренней поверхности крышки, не попадала на поверхность посева и не размывала выросшие колонии.

2-й день исследования

Изучают культуральные свойства чистой культуры, выросшие колонии на третьей чашке. Их изучают невооруженным глазом, с помощью лупы, при малом увеличении микроскопа и иногда под стереоскопическим микроскопом.

Нужную колонию отмечают со стороны дна чашки восковым карандашом. Из нее делают мазок и окрашивают по Граму. При микроскопии изучают морфологические особенности и отношение бактерий к окраске по Граму. Из этой колонии делают пересев на питательные среды (МПА и МПБ). Посевы помещают в термостат для культивирования.

3-й день исследования

Изучают культуральные свойства бактерий на МПА и МПБ, делают мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. Убедившись в том, что бактериальная культура чистая, приступают к изучению ее биохимических (ферментативных) свойств, устанавливают подвижность, определяют чувствительность к антибиотикам и др.

В научно-исследовательской работе, особенно при генетических исследованиях, необходимо получать культуры заведомо из одной клетки. Такая культура называется клон. Для его получения чаще всего пользуются микроманипулятором. Этот прибор снабжен инструментами (иглами, пипетками) микроскопических размеров. С помощью держателя под контролем микроскопа их вводят в препарат с бактериями на предметном стекле и одну нужную клетку засевают в питательную среду.

Поиск по сайту: