ТЕМА 27. Использование в микробиологии ДНК-зондов

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Освоить сущность реакции гибридизации нуклеиновых кислот (ДНК-зонды), ознакомиться с ее компонентами и методами постановки.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Набор компонентов, реактивов для постановки реакции ДНК-зондов.

Приборы и аппаратура: аппарат для горизонтального электрофореза, вакуум-шкаф с подогревом, счетчик радиоактивности, настольная центрифуга на 10 тыс. об/мин, рентгенкассета с усиливающими экранами.

Метод ДНК-зонды основан на уникальном свойстве генетического материала организма — молекулы ДНК, состоящей из мононуклеотидов, образовывать двойную спираль путем комплементарного соединения азотистых оснований. Молекула ДНК образует двойную спираль, при которой азотистые основания первой цепи строго комплементарно соединяются водородными связями с азотистыми основаниями второй цепи, где аденин соединяется с тимином, гуанин – с цитозином.

Принцип метода состоит в том, что структуру двойной спирали ДНК (или РНК) можно разрушить нагреванием и при этом происходит разделение цепей. Этот процесс называется денатурацией или плавлением ДНК. Температуру, при которой происходит разделение цепей ДНК, называют точкой плавления, которая равняется 85-95°С. Этот процесс обратимый, то есть при снижении температуры происходит восстановление связей – образование двойной спирали. Это явление называют ренатурацией. Если при ренатурации взяты молекулы из разных источников, говорят о гибридизации. Способность к гибридизации двух препаратов нуклеиновых кислот является строгим тестом на комплементарность их последовательностей.

Гибридизацию можно осуществлять в растворе или на фильтре (капроновом или нитроцеллюлозном). Удобным для работы является метод гибридизации с использованием фильтров. При этом один из препаратов ДНК иммобилизуют на нитроцеллюлозных фильтрах, на которых молекула ДНК адсорбируется. Затем погружают их в раствор, содержащий второй препарат денатурированной ДНК (ДНК-зонд). Связывание ДНК-зонда происходит только в том случае, если она имеет последовательность нуклеотидов, комплементарную первоначально адсорбированной на фильтре молекуле ДНК (рис. 71).

Эффективность гибридизации определяют по количеству метки, оставшейся на фильтре. Метод является очень чувствительным. При этом необходимо иметь меченные радиоактивным изотопом РНК или ДНК-зонды, идентификация которых с исследуемой молекулой регистрируется с помощью радиоавтографии.

В качестве ДНК-зонда используют меченые копии ДНК с известной последовательностью нуклеотидов.

Метод блоттинга по Саузерну

Для идентификации гена молекулу ДНК-генома расщепляют с помощью ферментов рестриктаз на куски размером примерно по 15-20 тыс. пар нуклеотидов.

Расщепленный таким образом геном подвергается электрофоре-тическому фракционированию в агарозном геле. После этого фракции ДНК денатурируют нагреванием и переносят из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр, где их иммобилируют. Процесс переноса ДНК напоминает промокание (по английски – блоттинг) и называется методом блоттинга по Саузерну. Сущность блоттинга заключается в том, что агарозный гель помещают на фильтровальную бумагу, замоченную в концентрированном солевом растворе, затем на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр и сверху помещают сухую фильтровальную бумагу.

Солевой раствор впитывается в сухую бумагу, чтобы это произошло, он должен пройти сквозь агарозный гель и затем через нитроцеллюлозный фильтр. ДНК переносится вместе с раствором, но задерживается нитроцеллюлозой. Иммобилизованную таким образом ДНК можно гибридизировать на месте с радиоактивным зондом. Со специфичным зондом будут гибридизироваться только комплементарные ему фрагменты. Так как зонд радиоактивный, то гибридизацию можно обнаружить с помощью авторадиографии.

Рис. 71. Схема гибридизации на фильтре: А – иммобилизированная на фильтре одноцепочечная ДНК; Б – одноцепочечная ДНК в растворе; В – фильтр с иммобилизованной одноцепочечной ДНК опускается в раствор, содержащий денатурированную молекулу ДНК

Каждая комплементарная последовательность проявляется в виде радиоактивной полосы, месторасположение которой определяется размером фрагмента ДНК (рис. 72 А).

Метод блоттинга является высокочувствительным и широко применяется в различных областях, в том числе для диагностики инфекционных болезней сельскохозяйственных животных, например, для обнаружения возбудителей сибирской язвы, бруцеллеза, туберкулеза, ящура, чумы свиней, чумы птиц, энтеровирусов и т.д.

Генная дактилоскопия

Метод заключается в анализе гипервариабельных участков молекул ДНК, который включает следующие этапы: выделение ДНК, фрагментация ее с помощью электрофореза в геле. Фрагменты, содержащие гипервариабельные участки, выявляют с помощью специального зонда - «проба Джеффриса», с которой они связываются путем гибридизации, выявляемые авторадиографически.

В качестве радиоактивного зонда может быть использована ДНК, выделенная из бактериофага М-13.

Метод точечной (дот) гибридизации выполняется путем внесения исследуемых образцов ДНК в денатурированном состоянии на капроновые мембранные фильтры в виде точек. Например, ДНК микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота в количестве 3 мкл (1,8 мкг/мл) в виде точек наносится в квадраты (1,5 х 1,5 см). Одноцепочечные молекулы ДНК (денатурированные) адсорбируются на мембране и фиксируются. После этого на фильтр наносится ДНК-зонд, одноцепочечная молекула ДНК, выделенная, например, из Myc. bovis, меченая радиоактивным фосфором.

В случае совпадения азотистые основания молекул ДНК M. bovis и меченная ³²Р ДНК-зонда комплементарны, то происходит связывание азотистых оснований с образованием двойной спирали. После этого несвязанные молекулы ДНК-зонда отмываются и образующиеся гибридные молекулы выявляют радиоавтографически.

На рис. 72 Б представлены результаты исследования патологического материала на туберкулез.

А а) Расщепление ДНК-генома с помощью рестриктаз

электрофорез в агарозном геле

перенос (блоттинг) на нитроцеллюлозу

гибридизация с радиоактивным зондом

для обнаружения специфической последовательности

выявление гибридных молекул методом авторадиографии

б) Солевой раствор. Фильтровальная бумага,

вымоченная в концентрированном солевом растворе

Денатурация ДНК после фореза

ДНК иммобилизована в нитроцеллюлозном фильтре

Сухая фильтровальная бумага

Рис. 72, А. Схема метода блоттинга по Саузерну:

а) расщепление ДНК-генома с помощью рестриктаз на куски по 15-20 тыс. пар нуклеотидов, электрофоретическое разделение этих рестриктаз в агарозном геле, перенос их на нироцеллюлозный фильтр, гибридизация ДНК-зондом и выявление образующихся гибридных молекул методом авторадиографии.

б) схема переноса блоттинга

Б 1 2 3

Рис. 72, Б. Дот-гибридизация ДНК-зонда М. bovis:

А: 1- М. bovis: 2, 3 – ДНК из пораженной туберкулезом ткани;

В: 1, 2, 3 – ДНК, выделенная из тканей здоровых животных;

С: 1 – ДНК возбудителя бруцеллеза;

2 – ДНК возбудителя листерий;

3 – ДНК M. fortuitum

Как видно из рисунка, положительные результаты (образование гибридных молекул ДНК) получены с ДНК М. bovis и с ДНК из пораженной туберкулезом ткани (А-2, А-3).

Отрицательные результаты получены с ДНК, выделенной из тканей здоровых животных (В-1, В-2, В-3), а также из возбудителя бруцеллеза (С-1), возбудителя листерий (С-2), из М. fortuitum (С-3).

Методика постановки ДНК-ДНК-гибридизации по индикации возбудителя бруцеллеза

Подготовка проб исследуемого материала:

1. Берут небольшие кусочки (0,3-0,2 г) органов, тканей, гомогенизируют их путем растирания с кварцевым песком и добавлением физиологического раствора.

2. Лизис клеток проводят с добавлением 10%-го водного раствора додецилсульфата, доводя его концентрацию до 0,5-1,0 % и проназу до 500 мкг/мл. Смесь инкубируют при 37°С 30 мин.

3. Добавляют равный объем смеси хлороформ-изоамилового спирта, энергично встряхивают и центрифугируют при 10 тыс. об/мин. Верхнюю водную фазу осторожно переносят в другую пробирку и добавляют 2,5 объема холодного 96° этанола. При этом ДНК выпадает в осадок.

4. Осажденную ДНК подсушивают на воздухе и растворяют в 10-20 мкл воды.

5. Берут капроновый фильтр, расчерчивают на квадраты со сторонами 1,5 х 1,5 см и на них в несколько приемов наносят растворенный осадок, предварительно подогретый до 100°С.

6. Фильтры подсушивают и выдерживают 2 часа под вакуумом при 80°С.

Фильтры с зафиксированными на них образцами можно долго хранить при комнатной температуре в вакууме.

Приготовление ДНК-зондов

1. Из бруцелл выделяют ДНК и озвучивают ее ультразвуком при 22 кГц в течение 1 минуты.

2. Полученные фрагменты ДНК метят радиоактивным фосфором методом трансляции. Дня этого радиоактивный трифосфат (ТТР) в количестве 60 мк-Кюри выпаривают под вакуумом при комнатной температуре. В эту же пробирку добавляют 5 мкл (5 мкг) озвученной ДПК, по 2 мкл всех остальных трех немеченых трифосфатов, 4 мкл 10хник-буфера, 2 мкл ДНК-полимеразы 1 и 2 мкл 10000 раз разведенной ДНК-азы. Все это перемешивают и ставят на 2 часа при 15°С. Очистку зонда от невключившихся трифосфатов производят на колонке с сефадексом Ж-50. После этого этапа зонд готов для дальнейшей работы.

3. Капроновые фильтры с исследуемой ДНК запаивают в полиэтиленовые пакеты, оставив отверстие для внесения предгибридизационной смеси.

Состав предгибридизационной смеси:

Формамид 1,0 мл, 20хССЦ (ЗМ, 0,ЗМ цитрат натрия) - 1,2 мл 100х смеси Денхарда (1х-20го раствора фикола, 2%-ный поливинилпирролидина, 2%-го бычьего сывороточного альбумина) - 0,6 мл, ДНК из спермы лосося - 0,14 мл.

ДНК из спермы лосося предварительно денатурируется кипячением при 100°С в течение 5 мин. В пакет с фильтром вносят предгибридизационную смесь из расчета 0,5 мл на 1 см² фильтра и инкубируют при 46°С 2 часа.

4. Предгибридизационную смесь выливают и в пакет вносят гиб-ридизационную смесь, состоящую из раствора, указанного в пункте 3, а также денатурированную ДНК из спермы лосося, ДНК-зонд. Смесь инкубируют при 46°С 16-20 часов (оставляют на ночь).

5. Гибридизационную смесь выливают и отмывание фильтров проводят в следующем режиме: в растворе состава 2хССЦ - 0,1 % ДДС 2 раза по 15 мин при комнатной температуре, в таком же растворе при 60°С по 15 мин 2 раза. В конце фильтры ополаскивают в 0,1хССЦ 2 раза и высушивают при комнатной температуре.

6. Для учета реакции проводят радиоавтографию или радиоактивность определяют на счетчике.

7. Радиоавтографию проводят в следующем порядке: в рентгеновскую кассету (на экран) лейкопластырем приклеивают лист обычной бумаги, на него крепят фильтр после гибридизации и на последнюю накладывают в темноте рентген-пленку. Рентген-кассету закрывают, помещают в полиэтиленовый пакет и оставляют на ночь при –70°С или –20°С. После холодильника кассету выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре, затем в темноте вынимают пленку, проявляют и изображение закрепляют.

При наличии бруцелл в тканях в тех квадратах фильтра, куда они были нанесены, на пленке появляются черные пятна.

После установления бруцелл в исследуемых пробах необходимо определение видовой принадлежности бруцелл, которое проводится методом мультилокусной геномной дактилоскопии.

Поиск по сайту: