ТЕМА 23. Реакция связывания комплемента (РСК)

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Дать представление о сущности реакции связывания комплемента, применении ее в ветеринарно-лабораторной практике, получении и подготовке компонентов; освоить методы титрации компонентов для РСК, провести постановку главного опыта. Ознакомить с различными модификациями проведения РСК.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Пробирки в штативах, пипетки на 1,5 мл, резиновые груши, водяная баня с терморегулятором. Компоненты: физиологический раствор, гемолизин (1:100), эритроциты барана (1:40), комплемент (1:20), единый бруцеллезный антиген для РА и РСК, бруцеллезная (позитивная) и нормальная (негативная) сыворотки.

Демонстрационные наборы с результатами: проверки компонентов на антикомплементарность и гемотоксичность; титрования гемолитической сыворотки. Готовая шкала для оценки степени гемолиза эритроцитов. Таблицы по теме.

РСК, как и все серологические реакции, может быть использована в следующих направлениях:

1) для выявления специфических антител в сыворотке крови больных животных с включением в реакцию известного антигена при диагностике бруцеллеза, сапа, листериоза, лептоспироза и др.;

2) для определения в исследуемом материале специфического антигена с использованием известных иммунных сывороток, при диагностике ящура и установления его серотипов и др.

Сущность РСК заключается в том, что при взаимодействии антитела со специфическим для него антигеном происходит процесс связывания комплемента на этом комплексе. Этот процесс не проявляется визуально. Для выявления связывания комплемента к смеси, состоящей из антигена, антитела и комплемента, вводится гемолитическая система, состоящая из гемолитической сыворотки (гемолизина) и эритроцитов барана (рис. 68).

Рис. 68. Схема постановки реакции связывания комплемента: Аг – антиген; Ат – антитело; Эр – эритроциты; Гем. сыв. – гемолитическая сыворотка

Происходит полное связывание комплемента, если взятые для исследования антиген и антитело специфичны, гемолиз не происходит. На дне пробирки после инкубации в течение 20 мин при 37 °С и последующем выдерживании смеси в течение 20-24 ч при комнатной температуре образуется осадок негемолизированных эритроцитов. Если же антиген и антитело неспецифичны и не образуют комплекса, связывающего комплемент, последний остается в свободном состоянии и связывается в гемолитической системе, вследствие чего наступает гемолиз эритроцитов. Исследуемая смесь приобретает красный лаковый цвет, РСК, как и другие реакции иммунитета, протекает при строгих количественных соотношениях, взятых в опыт компонентов и точно оттитрованных количествах комплемента, гемолитической сыворотки, антигена и антител.

Существуют различные модификации реакции связывания комплемента, мы представляем методику постановки РСК при диагностике бруцеллеза. Реакция проходит в водяной бане при 37-38 °С в объеме 1 мл (по 0,2 мл каждого компонента – сыворотки, антигена, комплемента, гемолизина и эритроцитов).

При диагностике сапа и других болезней РСК ставится в объеме 2,5 мл, каждый из компонентов, входящих в реакцию, берется в объеме 0,5 мл.

До проведения главного опыта РСК определяют качество и проводят титрацию всех компонентов, входящих в реакцию.

1. Исследуемые сыворотки и контрольные (позитивная и негативная) разводят физраствором 1:5 или 1:10 и прогревают в водяной бане в течение 30 мин при 56-58°С для разрушения собственного комплемента.

2. Антиген бруцеллезный единый для РА, РСК, РДСК, изготовляемый на биофабрике, представляет собой гомогенную взвесь инактивированных нагреванием и карболовой кислотой бруцелл в физиологическом растворе.

3. Комплемент – нестойкий, легко разрушающийся компонент свежей сыворотки крови всех видов животных. Комплемент – вещество белковой природы, быстро инактивируется при нагревании, под действием света, слабыми растворами щелочей и кислот и др.

В наибольшем и в более постоянном количестве комплемент содержится в сыворотке крови морских свинок, поэтому ее используют в РСК. Кровь у морской свинки берут пункцией из сердца. Взятую в стерильную пробирку кровь ставят на 15-20 мин в термостат, затем кровяной сгусток отделяют стеклянной палочкой от стенки пробирки, оставляют в покое на 15-20 минут. Сыворотку отсасывают, переносят в чистую пробирку и хранят в холодильнике.

В настоящее время биопредприятия выпускают комплемент в лиофилизированном виде.

Для реакции комплемент разводят в физрастворе и определяют его активность.

4. Эритроциты барана. Кровь от барана (овцы) берут из яремной вены с соблюдением правил асептики в сосуд с бусами (стеклянными или фарфоровыми), закрытый ватной пробкой и дефибринируют продолжительным встряхиванием.

Полученную кровь центрифугируют при 1500-2000 об/мин, после чего надосадочную жидкость из центрифужной пробирки удаляют, а оставшуюся эритроцигарную массу ресуспензируют в физрастворе и вновь центрифугируют. Эти операции продолжают до тех пор пока жидкость над эритроцитами становится прозрачной. Отмытые эритроциты разводят для реакции физраствором 1:40, т.е. получают 2,5%-ную взвесь эритроцитов.

5. Гемолитическая сыворотка (гемолизин) получают на биопредприятиях путем гипериммунизации кроликов 25 или 50%-ной взвесью эритроцитов в физрастворе. Взвесь эритроцитов вводят роликам внутривенно 4-5 раз с 3-4-дневными интервалами. Через 7 дней после последнего введения у кроликов берут кровь. Получению сыворотку инактивируют 30 мин при 56-58° для разрушения кроличьего комплемента. Гемолизин консервируют глицерином 1:1 или 0,5%-ным фенолом и разливают по ампулам.

1. Проверка компонентов на антикомплементарность и гемо-токсичность по следующей схеме

Таблица 10

Водяная баня – 10 мин при 37-38°С.

Результат: Гемолиз. Полная задержка гемолиза.

В реакции используют компоненты, не обладающие антикомплементарными и гемотоксическими свойствами.

2. Титрование гемолизина проводят периодически один раз в 3 месяца при использовании каждой новой серии.

Для титрации гемолизина готовят разведения от 1:500 до 1:4000 по следующей схеме:

Таблица 11

После приготовления разведений гемолизина приступают к его титрованию по схеме.

Таблица12

Поиск по сайту: