Б. Непрямые методы

1. Исследуемый антиген (мазок)

2. Немеченые специфическая сыворотка или g-глобулин

3. Меченая антивидовая сыворотка.

1. Исследуемый антиген (мазок)

2. Немеченые специфическая сыворотка или g-глобулин

3. Комплемент

4. Меченая антикомплементарная сыворотка

Непрямые методы флюоресцирующих антител. Называются они так потому, что флюоресцирующая сыворотка (антитело) при этих методах адсорбируется не на антигене, а на посредника (на специфическое неокрашенное антитело или на комплемент, которые являются для флюоресцирующих антител антигеном).

Непрямой метод с использованием антивидовой флюоресцирующей сыворотки. Сущность и техника этого метода заключается в том, что на фиксированный мазок сначала наносят специфическую для предполагаемого в мазке антигена не меченую иммунную сыворотку или глобулин и выдерживают во влажной камере при 37°С 30-40 мин. Затем мазок осторожно промывают фосфатным буфером или просто дистиллированной водой. Если в мазке имеется антиген, то образуется комплекс «антиген-антитело», который при промывании мазка не смывается. Однако полученный комплекс невидим, чтобы его обнаружить в люминесцентном микроскопе, мазок дополнительно обрабатывают флюоресцирующей антивидовой сывороткой или глобулинами. Антивидовые сыворотки или глобулины получают путем гипериммунизации кролика (или другие виды животных) сывороткой или глобулинами того вида животных, от которых получают специфическую вирусному антигену гипериммунную неспецифическую сыворотку. Для этого на мазок наносят антивидовую флюоресцирующую сыворотку и снова контактируют во влажной камере при 36-37°С 30-40 мин. Затем мазок промывают и высушивают на воздухе. В результате антивидовая сыворотка адсорбируется на комплекс «антиген+антитело» и, поскольку антивидовая сыворотка или глобулины меченые, образовавшийся комплекс «антиген+антитело+антивидовое антитело» светится салатово-зеленоватым цветом.

Если же в первой стадии компоненты были неспецифичны или в мазке было мало антигена, комплекс «антиген+антитело» не образуется, и антивидовые антитела не свяжутся, при промывании мазка смоются с него и поэтому свечения не будет.

Непрямой метод с использованием антикомплементарной флюоресцирующей сыворотки по своей сущности и технике является разновидностью РСК, но ставится на предметном стекле, и роль гемолитической системы выполняет флюоресцирующая антикомплементарная сыворотка.

Для подтверждения специфичности результатов РИФ необходимы следующие контроли. Для прямого варианта проводят окраску гомогенных и гетерогенных в антигенном отношении микроорганизмов люминесцирующей сывороткой. Свечение бактерий должно быть в первом случае и отсутствовать во втором.

Для непрямого метода мазки, содержащие гомологичные и гете-рологичные в антигенном отношении микроорганизмы, обрабатывают люминесцирующей сывороткой. Бактериальные клетки не должны светиться. Мазки с гомологичными и гетерологичными бактериями обрабатывают иммунной (антимикробной) сывороткой (1-й этап) с последующим нанесением флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки (2-й этап). Специфическое свечение бактерий должно быть в первом случае и отсутствовать во втором».

Интенсивность свечения оценивается по четырехбальной системе: ++++ - очень яркая флюоресценция по периферии микробной клетки; +++ - яркая флюоресценция периферии клетки; ++ - слабое свечение периферии клетки; + - нет контрастного свечения периферии и тела микробной клетки. Реакцию иммунофлюоресценции засчитывают, если специфическое свечение микробных клеток на четыре или на три плюса.

Поиск по сайту: