ТЕМА 15. Методы изучения микроскопических грибов и ак-тиномицетов

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Ознакомить и освоить технику микологических исследований. Изучить морфологию грибов, дрожжей, дрожжеподобных грибов и актиномицетов.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОСНАЩЕНИЕ. Готовые препараты, приготовленные из микроскопических грибов и актиномицетов, чистые культуры грибов на питательных средах, препаровальные иглы, микологические крючки, предметные и покровные стекла, 50%-ный водный раствор глицерина, раствор метиленовой сини, спиртовки, микроскопы; схемы, таблицы.

Грибы (Fungi) – низшие растения, характеризуются следующими свойствами: широко представлены в природе, не имеют хлорофилла, наличие у большинства видов вегетативных органов гиф, которые, переплетаясь, образуют мицелий. Они относятся к аэробам, по типу питания – метатрофы, нетребовательны к условиям внешней среды.

Значение микроскопических грибов (плесени) в патологии сводится к тому, что они могут вызывать различные болезни, а их токсины массовые отравления у животных и человека.

Болезни, вызываемые патогенными грибами у человека и животных, называют микозами.

К микозам относятся дерматомикозы: стригущий лишай (трихофития, микроспория), парша; бластомикозы, кандидамикозы, аспергиллезы и др.

Болезни, возникающие при поедании животными кормов, пораженных различными видами токсических грибов, называют микотоксикозами. К ним относятся фузариотоксикоз, аспергиллотоксикоз, дендродохиотоксикоз, клавицепстоксикоз и др. Патогенные и токсигенные грибы относятся к классам: зигомицеты, аскомицеты, базидомицеты, дейтеромицеты. Они отличаются друг от друга по типу мицелия, по наличию и строению органов плодоношения, по типу спор и другим признакам.

При морфологическом изучении у грибов устанавливают вегетативное тело, которое у большинства грибов состоит из тонких ветвящихся нитей – гиф, образующих сплетение – мицелий.

По строению мицелия грибы подразделяются на низшие и высшие.

У низших грибов (фикомицеты) гифы не септированы и они представляют собой одну гигантскую клетку с многочисленными ядрами без перегородок.

У высших грибов (микомицеты) гифы имеют перегородки, разделяющие их на отдельные одноядерные или многоядерные клетки, называемые септами (рис. 43).

Рис. 43. Строение мицелий у микроскопических грибов: А — фикомицеты (мицелий не септирован); Б- микомицеты (мицелий септирован)

Другая группа грибов не образует мицелия – дрожжи, дрожжеподобные клетки, одноклеточные организмы, относящиеся к классу аскомицетов (сумчатые грибы).

Размножение грибов происходит двумя способами: вегетативным и репродуктивным. К последнему относится бесполое и половое размножение.

Вегетативное размножение может происходить за счет случайно оторвавшейся части мицелия.

Часть мицелия может превращаться в оидии (артроспоры), дающие начало новой грибнице. На более высших ступенях развития грибов на мицелии могут появляться хламидоспоры, которые отличаются от оидий более толстой оболочкой.

У дрожжей очень часто при размножении происходит простое деление клеток, которые остаются связанными вместе (почкование).

Репродуктивное размножение происходит с помощью спор, которые образуются бесполым и половым путем. Фикомицеты размножаются половым и бесполым путем. У микомицетов преобладает бесполое размножение.

Наиболее распространено бесполое размножение с помощью, спор, развивающихся на особых ответвлениях мицелия (спорангиеносцев), имеющих структуру мешков-спорангиев, в которых формируются споры (эндоспоры), характерные для низших мукоровых грибов, У грибов аскомицетов спорангии называют асками, а споры – аскоспорами.

Экзогенные споры – конидии – образуются на концевых участках особых гиф – конидиеносцы, которые могут быть простыми или разветвленными. У аспергиллов кониединосец на конце имеет округлое вздутие, на поверхности которого сплошным слоем расположены клетки в один или два ряда – стеригмы.

Микологическая диагностика сводится к:

1) микроскопии первичного исследуемого материала;

2) выделению чистой культуры возбудителя с использованием специальных питательных сред и определению его родовой и видовой принадлежности;

3) определению патогенных и токсигенных свойств на биологических моделях.

При микозах в лабораторию направляют соскобы с кожи с захватом волос на границе со здоровой тканью, соскобы со слизистых оболочек ротовой полости, молоко, трупы птиц и мелких животных и др.

При микотоксикозах направляют пробы кормов (солома, сено, зернофураж, комбикорм, отруби и др.), рвотные массы, от трупов – желудок, кишечник с содержимым, паренхиматозные органы и др.

Для микроскопического исследования на дерматоксикозы патологический материал предварительно обрабатывают 10-20%-ным раствором NаОН или КОН в течение 15-20 мин. Небольшое его количество препаровальной иглой или глазным пинцетом переносят на предметное стекло, добавляют 50%-ный водный раствор глицерина и накрывают покровным стеклом.

Микроскопию препарата «раздавленная капля» проводят под световым микроскопом с использованием объективов х8 и х40 в затемненном поле зрения (с прикрытой диафрагмой конденсора).

Морфологическая картина в препаратах, приготовленных из патологического материала, представлена: при трихофитии – мицелий не разветвлен, гифы и споры лежат правильными рядами вдоль волоса, при микроспории гифы и споры, по отношению к волосу, располагаются беспорядочно.

Для выделения чистой культуры микроскопических грибов проводят посевы на специальные питательные среды: сусло-агар, Сабуро, Чапека и др.

В состав суслового агара входит неохмеленное пивное сусло и 2 % агар-агара, среда Сабуро включает в себя глюкозу, пептон и агар-агар, среда Чапека – глюкозу, набор минеральных солей и агар-агар.

Посевы культивируют в термостате при 25-30°С.

Рост грибов на средах появляется на 7-10-й день.

При определении рода и вида грибов изучаются их морфологические особенности в динамике на питательных средах при соответствующих условиях. С этой целью колонии грибов, выросших на средах, микроскопируют под стереоскопическим или обычным микроскопом с объективом х8. Далее готовят препараты «раздавленная капля». Для этого препаровальными иглами или микологическим крючком отделяют небольшой участок мицелия с плодоносящими гифами и прилегающим к нему слоем питательной среды, переносят на предметное стекло в каплю 50%-ного водного раствора глицерина и придавливают покровным стеклом. Такие неокрашенные препараты микроскопируют как обычно.

Для выявления дрожжей и дрожжеподобных организмов готовят препараты для микроскопии, фиксируют физическим или химическим методами, окрашивают раствором метиленовой сини и микроскопируют.

Особенности строения некоторых низших и высших микроскопических грибов характеризуются следующими признаками.

Мукоровые грибы, или головчатая плесень (Mucor), относятся к фикомицетам – грибам с ветвящимся одноклеточным, пушистым, серовато-сизого цвета мицелием (рис. 44, 1).

В мицелии отсутствуют перегородки. Из мицелия поднимаются вверх спорангии в виде головок, которые содержат эндоспоры.

Пенициллиум, или кистевидная плесень (Penicillium), - род плесени, имеющий большое количество видов. В верхней части конидиеносец разветвлен и формирует кисть из стеригм с цепочками конидий на них (экзоспоры) (рис 44, 2).

Аспергилл, или леечная плесень (Aspergillus), обладает многоклеточным мицелием. На конце плодоносящей мицелиальной нити выступают округлые или булавовидные образования, от которых отходят в радиальном направлении короткие отростки – стеригмы, на конце последних экзоспоры (рис. 44, 3).

Фузариум (Fusarium) – плесень, обладающая мицелием, окрашенным в зависимости от вида гриба в различный цвет (желтый, коричневый и др.). Образует конидии серповидные: одноклеточные – микроконидии, многоклеточные – макроконидии. Гриб может образовывать также хламидоспоры (рис. 44, 5).

Стахиоботрис (Stachyobotrys) – мицелий септирован, многоклеточный, от которого вверх поднимаются споросные гифы конидиеносцы со стеригмами и сидящими на них конидиями. Конидиеносцы бесцветные, гладкие, в верхней части бородавчатые, оливко-бурого цвета (рис. 44, 4).

Рис. 44. Конидии и конидиеносцы у различных родов микроскопических грибов: 1 –Mucor; 2 –Penicillium; 3 – Aspergillus; 4 – Stachyobotrys; 5 – Fusarium

Дрожжевые грибы представляют собой крупные клетки овально-шаровидной формы. Они не образуют мицелия и размножаются различными путями: почкованием, делением, половым путем и эндоспорами, которые располагаются в особых сумках (асках) и называются аскоспорами (рис. 45).

Рис. 45. Дрожжевые грибы

Дрожжеподобные грибы не образуют истинного мицелия. Однако при размножении их клетки располагаются цепочками, вытягиваются в длинные нити, которые называют псевдомицелием.

Для определения токсичности грибов готовят экстракт из пораженного корма и выросшей культуры. Экстрагируют эфиром (можно ацетоном или хлороформом) в аппарате Сокслета или стеклянной банке с притертой крышкой. Экстракт выпаривают в водяной бане при 45-50°С под тягой. Токсичность определяют алиментарно (скармливанием) или постановкой кожной пробы.

Алиментарную пробу проводят на белых мышах, морских свинках, кроликах, цыплятах путем скармливания им исследуемого корма или вытяжки в течение трех дней.

Кожная проба ставится на кроликах. Для этого на свежевыбритый участок (размером 4-5 см²) втирают экстракт. В положительном случае через 1-3 дня отмечается гиперемия, отечность и далее некроз. Биопробу можно проводить на куриных эмбрионах, аквариумных рыбках, парамециях.

Актиномицеты (лучистые грибы) имеют сходное строение с микроскопическими грибами. Тело их представляет собой одну, очень разветвленную клетку (мицелий), которая состоит из цитоплазмы, недифференцированного ядра и оболочки. Толщина ветвящихся нитей мицелия – гиф – незначительна: от 0,2 до 1,2 мкм, длина может достигать нескольких десятков микрометров (рис. 46). На плотной питательной среде они образуют плотные колонии, врастающие в среду, которые сверху имеют конидиеносцы со спорами в виде мучнистого налета.

Учитывая особенности роста актиномицетов, мазки готовят следующим образом. Препаровальной иглой отделяют небольшой участок мицелия и помещают в каплю глицерина, затем покрывают его покровным стеклом и слегка прижимая, раздавливают мицелий. готовые препараты микроскопируют под малым и средним увеличением микроскопа с прикрытой диафрагмой.

Рис. 46. Морфология актиномицетов: 1 - мицелий; 2 - спорангии

Из патологического материала готовят обычным способом мазки, окрашивают простым методом и по Граму. Микроскопируют иммерсионным объективом.

Патогенные актиномицеты вызывают у животных и у человека болезнь, которая называется актиномикоз.

В организме больных животных актиномицеты образуют друзы – мелкие желтовато-белого цвета зерна (рис. 47).

Друзы извлекают из гноя петлей и помещают в каплю глицерина напредметное стекло, слегка придавливают покровным стеклом и вводят каплю раствора метиленовой сини. Микроскопию проводят объективами х8 и х40.

В центре друзы обнаруживают густое сплетение укороченных нитей с лучеобразно отходящими гифами, колбовидно утолщенными на концах. Окрашиваются актиномицеты метиленовой синью в бледно-голубой цвет, элементы гноя – в интенсивно синий цвет.

Рис. 47. Друзы Actinomyces bovis

Поиск по сайту: