ТЕМА 14. Культивирование анаэробных микроорганизмов

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ. Ознакомить и освоить методы, применяемые при работе с анаэробными микроорганизмами.

МАТЕРИАЛЬНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ. Анаэростат, эксикатор, вакуумный насос (водоструйный или масляный), водяная баня; питательные среды: МППБ, кровяно-сахарный агар (Цейсслера), сахарный агар, молоко, среда Вильсона-Блера; стерильные чашки Петри, трубки Веньяль-Вейона, стеклянные пластинки 6x6, пастеровские пипетки, спиртовки; таблицы, схемы.

К группе патогенных анаэробных микроорганизмов принадлежат возбудители эмфизематозного карбункула, столбняка, ботулизма, злокачественного отека, дизентерии ягнят, брадзота, энтеротоксемии, некробактериоза.

Для выделения и культивирования анаэробных микроорганизмов необходимы следующие условия, которые сводятся к созданию анаэробиоза, а также к использованию специальных питательных сред.

Создание анаэробиоза достигается несколькими методами.

1. Физический метод. Заключается в том, что посевы помещают в герметичный сосуд, из которого выкачивают воздух и помещают его в термостат. В этих целях применяют ряд приборов, из которых наиболее распространенным является анаэростат (рис. 40). Он представляет собой толстостенный металлический цилиндр, закрывающийся сверху массивной, хорошо притертой крышкой. Для создания наибольшей герметизации между крышкой и корпусом помещена резиновая прокладка. Внутри находится этажерка для размещения чашек Петри. В крышке прибора вмонтированы кран и вакуум-манометр.

Рис 40. Анаэростат для выращивания анаэробных бактерий

После того как во внутрь анаэростата помещены чашки Петри с посевами, его закрывают крышкой, которую фиксируют винтом. К открытому крану присоединяют масляный вакуумный насос и необходимую степень разряжения устанавливают по показателю вакуум-манометра. Когда воздух откачен, кран закрывают и анаэростат отсоединяют от насоса, а затем помещают в термостат.

При отсутствии анаэростата для выращивания анаэробов можно использовать эксикатор с краном в крышке.

2. Химический метод заключается в том, что в сосуд с посевами помещают химические реагенты, жадно поглощающие кислород. Для этого используют эксикаторы (рис. 41). В эксикатор помещают чашки Петри с посевами и открытую чашку с 10%-ным раствором едкого натра. На бортик эксикатора помещают пакетик с сухим пирогаллолом. Крышку эксикатора закрывают и легким движением высыпают пирогаллол в раствор едкого натра. Происходит мгновенная реакция с поглощением кислорода. В качестве поглотителя кислорода можно использовать также реакцию между углекислой содой и гидросульфитом натрия.

3. Комбинированный метод. Посевы помещают в эксикатор с краном и из него удаляют воздух механическим методом. Предварительно в эксикатор помещают химические реагенты – поглотители кислорода, которые дополнительно создают анаэробные условия.

4. Биологический метод создания анаэробиоза основан на совместном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в загерметизированных чашках Петри ( рис.42). Вначале вырастают аэробы, которые используют кислород, при ого отсутствии начинают расти анаэробы. Этот метод ненадежен и может быть использован только для культивирования нестрогих анаэробов.

Рис. 41. Эксикатор, который используют для создания анаэробных условий физическим или химическим методами

Питательные среды, на которых выращивают анаэробы, по своему составу аналогичны обычным средам. Отличаются лишь тем, что они сами по себе должны создавать анаэробные условия. С этой целью питательные среды разливаются высоким столбиком, до посева жидкие среды кипятят для удаления из них кислорода, а на их поверхность наслаивают вазелиновое масло для изоляции от атмосферного кислорода. Кроме этого в состав питательных сред входят различные редуцирующие вещества, уменьшающие содержание в них свободного кислорода. В качестве редуцирующих веществ обычно используют глюкозу (1-2%-ную), муравьинокислый натрий 0,3-0,5%-ный и пр. Часто в жидкие питательные среды опускают какие-либопористые вещества (кусочки тканей, пемзу, вату), которые адсорбируютна своей поверхности воздух.

Для выделения анаэробных бактерий из патологического материала, а также для их накопления и сохранения используют жидкую питательную среду Китта-Тароцци (мясо-пептонный печеночный бульон — МППБ). В состав МППБ входит печеночный экстракт с МПБ (1:1), который разливают по пробиркам высоким столбиком. На дно пробирки предварительно помещают кусочки вареной печени, а сверху после разлива среды наслаивают вазелиновое масло.

Рис. 42. Биологический метод создания анаэробиоза: совместное выращивание аэробных (I) и анаэробных (II) бактерий

В ряде случаев к МППБ добавляют стерильный раствор глюкозы в количестве 0,5 % (в пересчете на сухое вещество).

Для дифференциации патогенных анаэробов используют среды: кровяной агар Цейсслера, сахарный МПА, молоко, железо-сульфатный агар (среда Вильсона-Блера) и др.

Кровяной агар (Цейсслера): 3%-ный мясо-пептонный агар с 1-2 % глюкозы, смешивают (при температуре 50 °С) с 15-20 % свежей де-фибринированной крови барана, крупного рогатого скота, лошади.

Пользуются также кровью кролика или морской свинки, добавляя ее в количестве 5-7 %. Питательную среду разливают по чашкам Петри и подсушивают в термостате 20-30 мин. После посева культуры выращивают в анаэробных условиях.

Сахарный агар готовят на бульоне Мартена с добавлением 0,1 % глюкозы и 2 % агар-агара.

Молоко обезжиривают и разливают по пробиркам высоким столбиком и сверху наслаивают вазелиновое масло.

Железо-сульфитный агар (Вильсона-Блера). К 100 мл 3%-ного МПАс 10% глюкозы прибавляют 10 мл 20%-ного раствора сульфита натрия и 1 мл 8%-ного раствора хлорида железа. Черные колонии образуют анаэробные бактерии за счет восстановления сульфита натрия в сульфат натрия, который, соединяясь с хлорным железом, образует черный осадок сульфида железа.

Изолированные колонии анаэробов можно получить, используя различные методы.

Метод Виньяль-Вайона основан на том, что исследуемый материал разводят в расплавленном до 45 °С сахарном МПА. Затем из каждой пробирки быстро насасывают агар в стерильную пастеровскую пипетку. Тонкий конец пипетки запаивают. Запаянные пипетки помещают в термостат в стеклянном цилиндре. В зависимости от исходной концентрации в той или иной пипетке через 2-3 суток после посева можно наблюдать образование изолированных колоний. При необходимости исследовать колонию, трубку надпиливают и разламывают, а столбик агара выдавливают в чашку Петри и извлекают колонии бактериологической петлей.

Получить изолированные колонии анаэробов можно, используя метод Перетца. Для этого в чашки Петри помещают стеклянные палочки или спички и на них укладывают стеклянные пластинки размером 6x6 см. Исследуемый материал разводят расплавленным и остуженным сахарным МПА. Содержимое пробирок быстро перемешивают и выливают в чашки таким образом, чтобы агар заполнил пространство между стеклянной пластинкой и дном чашки. Толщина агарового слоя под стеклом должна быть равна 1-2 мм. Посевы инкубируют в термостате при 37°С. Через 18 ч под пластинкой вырастают колонии анаэробов. Выделение чистых культур анаэробных бактерий проводится в следующем порядке.

Первый день. Исследуемый материал засевают в несколько пробирок в среду накопления Китта-Тароцци градуированной или пастеровской пипеткой. Перед посевом эту среду прогревают в кипящей водяной бане 10-20 мин для удаления растворенного в ней воздуха, а затем охлаждают до 30-37 °С.

Часть пробирок с посевами прогревают в водяной бане при 80 °С 20 мин для уничтожения неспоровых форм бактерий. Затем все посевы культивируют в термостате при 37 °С.

В этот же день проводят заражение лабораторных животных исследуемым материалом.

Второй день. При росте анаэробов в среде Китта-Тароцци обнаруживают появление помутнения или помутнение и газообразование. Материал для приготовления мазков берут пастеровской пипеткой, которую опускают через слой масла до дна пробирки. Масло с поверхности стенок пипетки удаляют стерильной ватой при помощи пинцета. Эту операцию производят аккуратно над сосудом с дезинфицирующим раствором.

Мазки готовят обычным способом, фиксируют на пламени и окрашивают по Граму. При микроскопии регистрируют наличие грамположительных палочковидных форм (со спорами или без спор) и пересевают культуру из среды Китта-Тароцци на плотные питательные среды: для выделения чистой культуры и изучения культуральных свойств бактерий. Для этого подготавливают три чашки Петри с кровяно-сахарным МПА. Каплю материала со среды Китта-Тароцци наносят на поверхность плотной питательной среды, распределяют ее стеклянным шпателем. Этим же шпателем последовательно производят пересев на вторую и третью чашки.

Посевы на 24-48 часов помещают в анаэростат или другие приборы и инкубируют при 37 °С.

Изолированные колонии анаэробных микробов можно получить в глубине плотной питательной среды. Для этой цели используют также метод последовательного разведения с применением трубок Вейон-Виньяля или метод Перетца.

Третий день. Производят изучение выросших изолированных колоний и из типичных делают мазки и отсевают в среду Китта-Тароцци для выделения чистой культуры анаэробных бактерий.

Четвертый день. Из выросшей культуры на МППБ готовят мазки, окрашивают по Граму, проводят микроскопию и убеждаются в том, что выделена чистая культура бактерий.

Полученную культуру засевают на дифференциальные питательные среды: кровяно-сахарный МПА, сахарный МПА, молоко, на среду Вильсона-Блера.

Пятый день. Проводят идентификацию выделенной культуры из исследуемого материала по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, а также и вирулентным свойствам.

После гибели лабораторного животного от заражения производят бактериологическое исследование трупа. С этой целью из патологического материала готовят мазки, окрашивают их по Граму, проводят посев на МППБ и дифференциальные питательные среды.

При необходимости проводят исследования по обнаружению токсина биологическим методом на лабораторных животных.

Сроки лабораторного исследования на анаэробные инфекции колеблются от 8 до 15 дней.

Поиск по сайту: