Работа 5. Изучение влияние температуры и рН среды на активность трипсина

Оборудование и реактивы: пробирки, пипетки на 10 мл, две водяные бани, 1 мМ растворы БАПНА в 0,05 М фосфатном буфере со следующими значениями рН: 9, 7.6, 6, 5, раствор трипсина (10 мкг/мл), 1 н HCl.

1. Для изучения влияния рН среды на активность трипсина пользуются растворами БАПНА с разными значениями рН, по 2 опыта и 2 контроля в каждой параллели. Активность определяют по схеме.

Измеряют оптическую плотность при 364 нм. Удельную активность фермента выражают в мкМ п-НА, отщепленного 1 мкг трипсина за 1 мин, по калибровочной кривой. Строят график зависимости активности трипсина от рН среды.

2. Для изучения влияния температуры среды на активность трипсина пользуются этой же схемой, используя раствор БАПНА со значением рН=7,6, но пробирки инкубируют:

а) при комнатной температуре;

б) при 4 °С (Инкубировать в холодильнике. Использовать предварительно охлажденные растворы!);

в) на водяной бане при t=55 °С;

г) на водяной бане при t=75 °С.

Содержание отчета

1. График зависимости активности трипсина от рН среды.

2. График зависимости активности трипсина от температуры.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ И АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

Принцип метода. Процесс трансаминирования вклю­чает межмолекулярный перенос аминогруппы с донорной а-аминокислоты на акцептор а-кетокислоту без промежу­точного образования аммония. Высокое содержание трансаминаз отмечается в тканях печени, сердца, мышц, почек животных. Реакции трансаминирования играют ключе­вую роль в промежуточном метаболизме, обеспечивая син­тез и разрушение аминокислот в живых клетках. Так, например, аминокислоты, глутаминовая, аспарагиновая кислоты и аланин, превращаются в соответствующие а-кетокислоты, являются компонентами цикла трикарбоновых кислот и могут служить источниками энергии. Простетической группой трансаминаз является пиридоксальфосфат, который осуществляет перенос аминогруппы [1].

В результате переаминирования, происходящего под действием АсаТ и АлаТ, образуются соответственно щаве- левоуксусная и пировиноградная кислоты.

Щавелевоуксусная кислота далее относительно легко превращается в пировиноградную кислоту, которая при добавлении 2,4-динитрофенилгидразина в щелочной сре­де образует окрашенный гидразон пировиноградной кис­лоты. Интенсивность окраски гидразона, пропорциональ­ная концентрации пировиноградной кислоты, определя­ется колориметрически.

Оборудование: фотоэлектроколориметр, термостат, рН-метр, аналитические весы.

Посуда: пробирки — 15 шт.; пипетки на 0,2 мл — 2 шт., на 1 мл — 4 шт., на 10 мл — 1 шт.; колбы мер­ные на 100 мл — 6 шт., на 500 мл — 1 шт.

Реактивы: одно- и двухзамещенный фосфорнокислый натрий; D,L — аспарагиновая кислота; фенилаланин; а-кетоглутаровой кислоты динатриевая соль; 2,4-динитрофенилгидразин; натрий пировинограднокислый; натр едкий; соляная кислота.

Для приготовления реактивов используется дистил­лированная вода, свободная от карбонатов.

Приготовление растворов. Буферный раствор готовят путем смешивания 0,1 М растворов Na2HP04 и NaH2P04 до рН 7,4 на рН-метре.

Субстратный раствор для определения активности АсТ (реактив 1) готовят, растворяя 29,2 мг а-кетоглутаровой кислоты и 2,66 г 1),£-аспарагиновой кислоты в 1 М раство­ре NaOH. Едкий натр приливают осторожно, небольшими порциями до полного растворения осадка и до достижения величины рН 7,4. Для измерения рН пользуются универ­сальной индикаторной бумагой или рН-метром. Раствор переливают в мерную колбу емкостью 100 мл, ополаскива­ют посуду фосфатным буфером рН 7,4 и доводят им объем до метки колбы. Полученный субстратный раствор тщательно перемешивают, прибавляют 1 каплю хлоро­форма и сохраняют в холодильнике в замороженном виде.

Субстратный раствор для определения активности АлТ (реактив 2) готовят, растворяя 29,2 мг а-кетоглутаровой кислоты и 1,78 г D,L-аланина, как описано выше при приготовлении реактива 1.

Раствор ДНФГ готовят, растворяя 19,8 мг ДНФГ в небольшом количестве 1 М раствора соляной кислоты при нагревании на водяной бане. После охлаждения объем доводят до 100 мл. Раствор оставляют на сутки, затем фильтруют и хранят в посуде из темного стекла в холо­дильнике. Срок годности — 1 год.

0,4 М раствор NaOH готовится путем растворения 8 г щелочи в 500 мл дистиллированной воды.

Стандартный раствор пировинограднокислого на­трия готовят, растворяя 11 мг пирувата натрия (бело­го цвета) в мерной колбе емкостью 100 мл и дополня­ют дистиллированной водой до метки. Полученный 1 мМ раствор используют для построения калибровоч­ного графика.

Реактивы для построения калибровочного графика разливают в пробирки согласно таблице 15.

В каждую из пробирок с пробами для построения ка­либровочной кривой добавляют по 0,5 мл 2,4-динитрофе- нилгидразина, инкубируют 20 мин, а затем приливают по 5 мл 0,4 М раствора NaOH. Измеряют поглощение проб на фотоколориметре при 530 нм (зеленый светофильтр) в кюветах шириной 1 см, сравнивая с контрольной пробой, в которую вместо раствора пировиноградной кислоты до­бавляют дистиллированную вод

Таблица1 Состав проб для построения калибровочного графика определения активности трансаминаз

При построении калибровочного графика по оси ординат откладывают данные поглощения растворов (D, усл. ед.), а по оси абсцисс — соответствующую ей активность фермента в микромолях пировиноград­ной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час инкубации (и, мкмоль/ч).

Ход работы. Ингредиенты для определения активно­сти АсТ и АлТ вносят в пробирки в последовательности, указанной в таблице 2 (субстраты для АсТ и АлТ вно­сят в соответствии с определяемым ферментом).

Таблица 2 Пробы для определения активности аминотрансфераз

После перемешивания опытные и контрольные про­бирки инкубируют в термостате при 37°С: пробы на АсТ — 60 мин, АлТ — 30 мин. Затем во все пробирки добавляют по 0,5 мл 2,4-динитрофенилгидразина и ос­тавляют на 20 мин при комнатной температуре для про­текания реакции образования гидразона. После этого в пробирки приливают 5 мл 0,4 М NaOH, содержимое тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре еще на 10 мин для развития окраски. Оп­тическую плотность проб измеряют в кювете шириной 1 см при 500-560 нм (зеленый светофильтр) против кон­трольной пробы.

Метод расчета. Определение активности АсТ и АлТ проводят по калибровочному графику.

ОЧИСТКА АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ СЕМЯН ПШЕНИЦЫ

Принцип метода. Гель-хроматография — это способ разделения веществ на основе разницы в их молекуляр­ной массе (размера частиц) [4]. В качестве носителей в гель-хроматографии используются сефадексы (G-10, G-15, G-25, G-50, G-75, G-100, G-150, G-200), основой которых является полисахарид декстран, сшитый поперечными связями, формирующих трехмерную сетчатую структуру с высокой степенью гидрофильности за счет большого ко­личества на их поверхности полярных гидроксильных групп. Сефадекс не растворим в воде и стабилен в кислот­ных, щелочных и солевых растворах. После погружения в воду сефадекс набухает, приобретая способность фрак­ционировать различные молекулы в зависимости от их размера. Крупные частицы, имеющие более высокую мо­лекулярную массу, двигаются значительно быстрее час­тиц меньших размеров, которые задерживаются внутри гранул сефадекса.

Таким образом достигается разделение (фракциони­рование) молекул, которое используется для: а) обессоливания растворов;

б) отделения мелких по размеру и молекулярной массе молекул от крупных.

Гель-фильтрация используется для очистки ферментов от субстра­тов и кофакторов или белков от аминокислот и пепти­дов и т. д.

Оборудование: фотоэлектроколориметр с проточной кюветой или Uvicord (LKB, Швеция), хроматографическая колонка (1 х 30 см), лиофильная сушка.

Посуда: стакан; пипетка на 5 мл; пробирки для сбора фракций элюции — 50 шт.

Реактивы: 500 мл 0,05 М раствор глицина; 100 мл 96%-ный этанол; сефадекс G-25 fine. Приготовление рабочих растворов. Раствор глицина готовится путем растворения 1,875 г глицина в 500 мл дистиллированной воды.

Хроматографическая колонка наполняется сефадексом G-25 fine, который предварительно набухал в тече­ние 24 ч при комнатной температуре в дистиллированной воде. Перед употреблением колонка промывается 0,05 М раствором глицина.

Построение калибровочного графика. В работе ис­пользуют калибровочный график, построенный для оп­ределения белка по Лоури [5].

Ход определения. Семена пшеницы гомогенизируют на механическом гомогенизаторе до получения однород­ной массы. Затем добавляют 0,05 М раствор глицина в соотношении 1:3 (на 1 г семян 3 мл раствора). Для уда­ления не полностью разрушенных клеток и ядер гомогенат центрифугируют 10 мин при 7000 g. В супернатант добавляют этанол до 70% концентрации, интенсивно встряхивают в течение 5 мин, смесь центрифугируют. Осадок после растворения в небольшом количестве 0,05 М раствора глицина наносят на колонку (1 х 30 см) с сефадексом G-25 fine, уравновешенную 0,05 М раствором гли­цина, элюирование проводят этим же раствором. Опти­ческую плотность элюируемых растворов измеряют при 280 нм с помощью прибора Uvicord (LKB, Швеция) или на спектрофотометре оборудованном проточной кюветой. Фракции с наибольшей активностью и малым фоном лиофилизируют. Образец содержит 90-95% алкогольдегидрогеназы от общего содержания белка. Концентрацию белка определяют по биуретовой реакции или методу Лоури, а активность фермента, как описано ниже.

Метод расчета. Результаты расчета записывают в таблицу 18.

Заполнение таблицы 18 проводят по следующим фор­мулам:

общий белок (мг) = С6елка(мг/мл) К (мл),

, ч cLD Vy - V2

общая активность Е (мкмоль/мин) =,

6,22 l-Vs-dtЕ

удельная активность (Е/мг) = 0дЦдИ^ белок'

где Свелка — концентрация белка в элюате (мг/мл); V — объем пробы (мл); сШ — поглощение (усл. ед.); 6,22 — коэффициент микромолярного поглощения; I — ширина

Таблица 18 Результаты очистки полученных препаратов алкогольдегидрогеназы зерновок пшеницы

кюветы, см; V\ — объем элюата, мл; V2 — объем экст­ракта, вносимого в пробирку, мл; V3 — конечный объем пробы в пробирке, мл; dt — время реакции, мин.

Выход по белку, активности рассчитывают по пока­зателям общего белка и общей активности, принимая их за 100% у исходных образцов, а степень очистки по величинам удельной активности, принимая показания исходных образцов за единицу.

Выводы.

АДГ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ (в реакции восстановления ацетальдегида)

Принцип метода. Алкогольдегидрогеназа (КФ 1.1.1.1.) катализирует реакции восстановления альдегидов, про­являя максимальную активность в физиологической об­ласти рН [6,7]. Активность фермента в реакции восстановления альде­гидов определяется по скорости убывания НАДН при 340 нм (коэффициент молярного поглощения 6,22 мМ-1см-1).

сы3-сх + надн2 „» снз—сн2—он+ над н

Оборудование: фотоэлектроколориметр, рН-метр, ана­литические весы.

Посуда: спектрофотометрические кюветы шириной 1 см; пипетки на 0,1 мл — 3 шт., на 5 мл — 1 шт.; кол­ба на 100 мл — 1 шт.

Реактивы: 100 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, рН 6,5; 10 мл 11,3 мМ раствора НАДН (8 мг/мл); 177 мл 0,1 М раствора ацетальдегида; 10 мл 2,5 мкМ раствора АДГ или супернатанта зерновок пшеницы или печени. Раствор НАДН и супернатант готовят перед выполнени­ем работы.

Приготовление рабочих растворов. Раствор НАДН готовят, растворяя 80 мг в 10 мл дистиллированной воды; раствор ацетальдегида готовят путем прибавления 1 мл 17,7 М раствора ацетальдегида к 176 мл дистиллирован­ной воды; раствор буфера готовят, смешивая 0,1 М ра­створы одно- и двухзамещенных фосфатов натрия на рН-метре до рН 6,5.

Ход определения. В спектрофотометрическую кюве­ту последовательно вносят 2,7 мл 0,1 М натрий-фосфат­ного буфера, рН 6,0, 0,1 мл 11,3 мМ раствора НАДН и 0,1 мл 2,5 мкМ фермента или супернатанта. Реакцию инициируют введением 0,1 мл 0,1 М раствора ацетальде­гида. За меру активности фермента принимали количе­ство микромолей НАДН, окисленного за 1 мин.

За ходом реакции следят на фотоэлектроколориметре при 340 нм (е = 6,22 мМ-1см-1), записывая изме­нения поглощения в течение 1 мин с интервалом 15- 20 сек.

Метод расчета. Результаты наблюдений записывают в таблицу 21.

Активность фермента определяют по тангенсу угла наклона кривой, которая построена на миллиметровой бумаге в координатах (£>, t) или по формуле для очищен­ных образцов (мкМ/мин) (1) и супернатанта тканей (мкмоль/мин г) (2).

dC dD dC dDVxV3

v = — =-------------------, m и = — =, (2)

dT 6,22Idt UJ dt 6,22lPV2dt y '

где dD — величина поглощения, усл. ед.; 6,22 — коэф­фициент микромолярного поглощения; I — ширина кю­веты, см; Р — масса навески растительной ткани, г; Vx — объем для экстракции, мл; V2 — объем супернатанта, вносимого в пробирку, мл; V3 — конечный объем пробы в пробирке, мл; dt — время реакции, мин..

Выводы. Записать величину определенной активно­сти фермента.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЭТАНОЛА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ И ВЫДЫХАЕМОМ ВОЗДУХЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭТАНОЛА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Принцип метода. Этанол является энергетическим ме­таболитом растительных и животных тканей, может об­разовываться в реакциях декарбоксилирования молочной кислоты — продукта анаэробного окисления углеводов или в реакциях, катализируемых АДГ [6-9]. В растительных и животных тканях уровень эндогенных алифатических спиртов и альдегидов регулируется с помощью дегидроге- назной системы, состоящей из двух ферментов — алко- голь- и альдегиддегидрогеназ. При физиологических рН среды равновесие алкогольдегидрогеназной реакции сдви­нуто в сторону образования этанола.

В данной работе предлагается определять содержание этанола в биологическом материале после его предвари­тельной микроперегонки. Концентрация этанола опреде­ляется по накоплению НАДН в ходе реакции его окисле­ния в присутствии алкогольдегидрогеназы.

Оборудование: термостат или водяная баня, фотоэлек- троколориметр, рН-метр, аналитические весы.

Посуда: колба на 500 мл; пипетки на 0,1 мл — 4 шт., на 5,0 мл — 1 шт.

Реактивы: 0,1 М глицин-NaOH буфер, рН 10; водный раствор НАД (24 мг/мл); раствор йоднитротетразолия фиолетового (0,25 мг/мл); раствор алкогольдегидрогена­зы (активность фермента составляет около 24 ME) из се­мян пшеницы; 0,082 М раствор этанола; супернатант ткани или кровь; отгон из биологического материала.

Приготовление рабочих растворов. Раствор алкоголь­дегидрогеназы готовят перед употреблением путем ра­створения лиофилизированного препарата из расчета 20 мг на 1 мл бидистиллированной воды; раствор ИНТФ готовят, растворяя 3,8 мг навески в 1 мл бидистилли­рованной воды; раствор этанола готовят добавляя к 0,5 мл 16,4 М (96%-ного) этанола 195 мл бидистилли­рованной воды; буферный раствор готовится из исход­ных 0,1 М растворов глицина и NaOH на рН-метре; от­гон получают путем микроперегонки этанола из биоло­гического материала.

Пример конкретного выполнения. 3 мл сыворотки по­мещают в пенициллиновый флакон. Туда же помещают стеклянные или пластмассовые открытые капсулы объе­мом 0,8-1,0 мл так, чтобы верхний слой капсулы был на 2-3 см выше уровня сыворотки во флаконе. В капсулы опускают наконечники охлаждающей системы. Нагрева­ют флаконы на водяной бане при 80°С в течение 1 ч. Пары летучих жидкостей, включая этанол, конденсиру­ются на охлаждающих наконечниках микроперегонки и стекают в капсулу, объем конденсата в капсуле составля­ет 0,3-0,5 мл. При этом достигается отделение этанола от белков и многих других веществ плазмы крови, а также его концентрирование. Измеряют точный объем собранного конденсата в капсуле. Подготовленная про­ба может храниться в закрытой капсуле несколько дней.

Построение калибровочного графика. Калибровочный график строят, используя раствор этанола с известной концентрацией от 1,64 до 6,56 мМ. Для этого определя­ют зависимость начальной активности фермента, приго­товленного перед измерением раствора алкогольдегидро­геназы, от концентрации стандартных растворов этано­ла, как описано выше в работах 7.6.1. или 7.6.2.

Определение этанола в отгоне. В спектрофотометри- ческую кювету последовательно вносят 1,9 мл 0,1 М гли- цин-NaOH буферного раствора, рН 10, 0,1 мл 36 мМ вод­ного раствора НАД, 0,1 мл ИНТФ (0,25 мг/мл) и 0,2 мл отгона из капсулы. После перемешивания смеси в кюве­те реакцию инициируют введением 0,2 мл раствора ал­когольдегидрогеназы. За изменением поглощения раство­ра в кювете следят при 510 нм на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре.

Метод расчета. По калибровочной кривой находят концентрацию этанола в кювете. Затем рассчитывают концентрацию этанола в сыворотке крови *по формуле:

[ЭТАНОЛ]крови = CAB, мкмоль/мл,

где С — концентрация этанола, определенная по калиб­ровочному графику, мкмоль/мл; В — коэффициент кон­центрирования при отгоне этанола из сыворотки, равный отношению объема взятой сыворотки к объему отгона в капсуле; А — коэффициент разведения отгона в кювете.

Поиск по сайту: