Определение активности амилазы

Принцип метода. а-Амилаза (а-1,4 Д-глюкан-глюканогидролаза, КФ 3.2.1.1) катализирует реакцию гид­ролиза а-1,4-гликозидных связей крахмала [1]. Конеч­ными продуктами гидролиза крахмала являются маль­тоза и мальтотриоза

Рис. 1 Действие а-амилазы на а-1,4-гликозидные связи крахмала и амилозы [2]

Основным источником амилазы у человека и живот­ных являются поджелудочная железа и слюнные желе­зы. Хотя фермент вырабатывается в различных органах, но обе формы идентичны по каталитическим свойствам и почти не различаются по электрофоретической под­вижности. Активность амилазы может возрастать в при­сутствии ионов хлора. Оптимум рН фермента приходит­ся на 6,5-7,5. Фермент содержит один ион кальция на молекулу белка. Поэтому в присутствии оксалата и цитрата наблюдается ингибирование активности ами­лазы, которая обусловлена связыванием ионов кальция этими соединениями [2].

В основе предлагаемого метода используется реакция гидролитического расщепления нерастворимого цветно­го крахмального субстрата а-амилазой, протекающая с выделением свободного синего, растворимого в воде кра­сителя. Количество освобожденного красителя в едини­цу времени пропорционально активности фермента.

Оборудование: рН-метр, спектрофотометр или фотоэлектроколориметр, центрифуга, магнитная мешалка, термостат.

Посуда: пипетки на 0,1 мл — 2 шт., на 1 мл — 2 шт., 2 мл — 2 шт.; колбы мерные на 50 мл — 2 шт.; стакан на 50 мл; воронка.

Реактивы: концентрированный буферный раствор (0,6 М фосфатный буферный раствор, рН 7, с 0,1 М NaCl);

субстрат (цветной крахмал) — 0,6 г;

осаждающий раствор (3%-ный раствор ТХУ с 1,85 М магнием сернокислым).

Приготовление рабочих растворов. Буферный раствор. В мерную колбу емкостью 50 мл вносят 5 мл концентри­рованного буферного раствора и разбавляют водой до мет­ки. Перед использованием проверяют рН буфера.

Суспензия субстрата. В стакан емкостью 50 мл вносят 10 мл разбавленного буферного раствора и при постоянном перемешивании на магнитной мешалке медленно добавля­ют 0,1 г субстрата (цветного крахмала). Продолжают пере­мешивать до возникновения гомогенной суспензии (15- 20 мин). Приготовленную таким образом суспензию мож но хранить одну неделю при температуре от +1 до +4°С.

Ход работы. Определение активности а-амилазы про­водят следующим образом. В опытную и контрольную пробирки вносят по 1 мл суспензии субстрата. Пробирки прогревают в течение 5 мин при 37°С, затем добавляют в опытную пробирку 1,0 мл сыворотки крови (или супернатанта ткани, в которой определяется активность фер­мента), а в контрольную пробирку — 1,0 мл дистилли­рованной воды. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют точно 15 мин при 37°С. После этого добав­ляют в обе пробирки по 2,0 мл осаждающего раствора, перемешивают при комнатной температуре 15 мин. Супернатант отделяют от образовавшегося осадка центри­фугированием 5-10 мин при 3000 об/мин, переносят в кювету шириной 0,5 см, затем измеряют поглощение (D) растворов из опытной пробирки по сравнению с раство­ром из контрольной пробирки при 590 нм.

Метод расчета. Активность а-амилазы (v) в пробе опре­деляют по следующей формуле:

v = Dx1083 (Е/л).

Поиск по сайту: