МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ

Вирусы - это облигатные внутриклеточные паразиты, не способные размножаться ни в одной из бесклеточных сред.

Для культивирования вирусов используются следующие живые объекты:

1) культуры клеток (тканей, органов);

2) куриные эмбрионы;

3) лабораторные животные.

1. КУЛЬТУРА КЛЕТОК.

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток. Все культуры однослойных клеток можно разделить на:

а) первичные (первично трипсинизированные);

б) перевиваемые;

по происхождению:

а) эмбриональные;

б) опухолевые;

в) из взрослых организмов;

по морфогенезу:

а) фибробластные;

б) эпителиальные.

Первичные культуры клеток - это клетки различного типа, получают следующим образом: взятую ткань (эмбриональную или из взрослых организмов) механически измельчают, затем обрабатывают ее протеолитическими ферментами (трипсином). После отмывки и подсчета клеток суспензию разбавляют питательной средой и дают возможность клеткам прикрепиться к плоской поверхности стеклянных или пластмассовых сосудов. В результате деления клеток на поверхности сосудов образуется сплошной монослой клеток. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердой поверхностью, на которой они выращивались, что ведет их к гибели.

Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов широко используются как в лабораторных исследованиях, так и для производства вирусных вакцин.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом.

Перевиваемые штаммы клеток (диплоидная клетка) - клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов, полученные из эмбрионов человека, широко используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.

Источником перевиваемых линий и штаммов клеток являются первичные клеточные культуры, отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур - трансформированными.

Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток, как HeLa - получена из карциномы шейки матки, Hep-2 - из карциномы гортани, Детройт-6 - из метастаза рака легкого в костный мозг, RH - из почки человека, ВНК-21 - из почек однодневных сирийских хомяков, ПМС - из почки морской свинки и др.

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят синтетические стандартные среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемым компонентом большинства ростовых сред является сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

Поиск по сайту: