ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА СПИДА

В настоящее время при диагностике ВИЧ-инфекции используется:

1) Определение наличия вируса или его антигенов в материале от больного (виру-сологическими методами или ИФА);

2) Серологическая диагностика. Выявление специфических антител к поверхностным (gp.120;gp.41) и внутренним (p.24;p.17) антигенам ВИЧ;

3) Выявление патогномоничных (специфических) для ВИЧ-инфекции изменений в иммунной системе;

4) Определение возбудителей заболеваний, сопутствующих ВИЧ инфекций и инвазий.

I. Вирусологическая диагностика. Получение материала. Материалом для выделения ВИЧ служат Т-лимфоциты крови, лейкоциты костного мозга, л/у, ткани мозга, слюна, сперма, спинномозговая жидкость. Полученным материалом заражают перевиваемую культуру Т-лимфоцитов (H9). Индикацию ВИЧ в культуре клеток проводят по ЦПД (образо-вание симпластов), а также методами иммунофлуоресценции, электронной микроскопии, по выраженной активности обратной транскриптазы. Современные методы исследования позволяют обнаружить один инфицированный лимфоцит на 1000 клеток.

Точными и достоверными являются методы гибридизации нуклеиновых кислот. Они основаны на способности одноцепочечных комплементарных нитей нуклеиновых кислот, меченных радиоизотопом или ферментом (зондов), образовывать с вирусспецифическими нуклеиновыми кислотами из исследуемого материала двунитчатые структуры. Эти методы дают возможность идентифицировать 1 вирусную частицу в 10 мл крови, содержащей ВИЧ. Выявление вирусных антигенов в инфицированных Т-лимфоцитах осуществляют с помощью моноклональных антител. Однако эти методы пока что доступны только крупным лабораториям.

II. В настоящее время наибольшее распространение получили методы, основанные на выявлении противовирусных антител - серологическая диагностика.

Для проведения серологического исследования на СПИД берут 5 мл гепаринизированной крови, которую до доставки в лабораторию можно хранить 6 - 8 ч в охлажденном, но не в замороженном состоянии.

С целью серологической диагностики СПИДа используют прежде всего методы иммуноферментного анализа со стандартными иммуноферментными системами (ИФА). Это скрининговый метод. Принцип их работы основан на классическом принципе прямого ИФА. Иммуносорбентом являются полистироловые планшеты с иммобилизированным инактивированным вирусспецифическим антигеном, полученным из ВИЧ, либо синтетически. Затем следует внесение испытуемой сыворотки в разведении и инкубация в лунках с антигеном. После связывания АГ с АТ следует трехкратное отмывание несвязавшихся белков, а после этого в лунки вносят коньюгат антител к иммуноглобулинам человека с ферментной меткой. Образование специфического комплекса аГ+ АТ выявляют внесением субстрата для фермента (раствор ортофенилендиамина и перекиси водорода). В результате окраска среды меняется пропорционально количеству антител. Учет результатов проводят на спектрофотометре «Мультискан». Сыворотки крови, имеющие вирусспецифические антитела по данным ИФА, в дальнейшем необходимо исследовать методом иммунного блотинга.

Иммуноблотинг является подтверждающим тестом. Он основан на предварительном фракционировании по молекулярной массе (разделении) белков ВИЧ электрофорезом в полиакриламидном геле с последующим перенесением антигена на мембрану из нитроцеллюлозы. Т.е. белки вируса фиксированы на нитроцеллюлозной мембране на определенном расстоянии друг от друга. Затем на нитроцеллюлозную мембрану наносится испытуемая сыворотка. При этом специфические антитела образуют комплекс АГ+ АТ с конкретным АГ (gp.120, gp.41, p.24, p.18). Заключительный этап исследования состоит в выявлении антител к различным белкам ВИЧ. Для этого в систему добавляют антитела против белков человека, меченные ферментом или радиоизотопной меткой. Таким образом, в сыворотке пациента выявляют (либо не выявляют) вирусспецифические антитела к определенным антигенам ВИЧ.

III. Исследования иммунного статуса направлены на выявление:

1) уменьшения CD4/CD8 (в N 2 и >, при СПИДе - 0,5 и <);

2) снижения CD4 клеток (<200 клеток/мл.);

3) наличия одного из лабораторных признаков, включающих анемию, лейкопению, тромбоцитопению, лимфопению;

4) повышения концентрации Ig A и Ig G в сыворотке крови;

5) снижения реакции бласттрансформации лимфоцитов на митогены;

6) отсутствия кожной реакции ГЗТ на несколько антигенов;

7) повышения уровня циркулирующих иммунных комплексов.

Поиск по сайту: