Анти VEGF терапия

В настоящее время анти-VEGF препараты применяются в качестве адъювантного лечения при метастазах опухолей. Ингибиторы VEGF — это моноклональные антитела, которые селективно связываются с VEGF, блокируя его действие. Они подавляют неоангиогенез в опухолях, лишая их возможности дальнейшего роста (Кузьмин и др., 2009).

Первым антиоангиогеным препаратом стал бевацизумад (Avastin). Бевацизумаб представляет собой моноклональные антитела против VEGF; рекомбинантные IgG1-подобные антитела, с молекулярной массой около 149 кДа, произведенный в системе экспрессии клеток линии CHO, в питательной среде, содержащей антибиотик гентамицин. Препарат рассчитан на внутривенное введение и выпускается в дозах 100мг и 400 мг в одноразовых ампулах, с концентрацией в растворе 25мг/мл (Базин и Гарин, 2008).

Препарат связывается со всеми изоформами VEGF, препятствуя тем самым взаимодействию лигандов с рецепторами VEGFR; т.е. блокирует инициацию клеточного сигнала, ведущего к пролиферации эндотелиальных клеток. Бевацизумаб не связывается с другими ангиогенными факторами, такими как факторы роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста и др (Salvatore and Fock 2007).

Применение бевацизумада в сочетании с традиционной химиотерапии продемонстрировало значительное снижение ангиогенеза и метастазирования колоректального рака, рака молочной железы и лёгочной карциомы [60-63]. Более того был создан препарат аналогичного с бевацизумадом действия получивший название ранибизумад, который значительно снижает прогрессирование влажной маскулярной дистрофии и повышает общую остроту зрения. Ранибизумад, является фрагментом антитела, которое нейтрализует фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Успехи в борьбе с онкологическими заболеваниями антиангиогенными средствами способствовали созданию препаратов второго поколения. Такими препаратами на сегодняшний деньявляютсяСорафениб, Сунитиниб и Вандетаниб, которые ингибируют рецепторы VEGFи другие тирозин киназные рецепторы. Сорафениб (Нексавар, Sorafenib/ Bayer) – одобрен управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA, США) в декабре 2005 года для клинического применения при метастатическом раке почки и первичном раке печени.

Сорафениб - 4-[4-[[4-хлоро-3-(трифторметил)фенил]карбомоиламино]
фенокси]- N -метил-пиридин-2-карбоксамид (Рис.6) – является ингибитором тирозинкиназных рецепторов PDGFR, VEGFR-1,-2,-3, С-Kit рецептор, а также фермента Raf, на сигнальном пути Ras-Raf-MEK-ERK (Lissandra et al., 2008).

Рис. 6. Структурная формула сорафениба.

Сунитиниб (Sunitinib, Sutent/ PfizerInc.) – одобрен управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA, США) в январе 2006 года для клинического применения при метастатическом раке почки и устойчивой к иматинибу форме рака желудочно-кишечного тракта.

Сунитиниб – N-[2-(диэтиламино)этил]-5-[(Z)-(5-фторо-1,2-дигидро-2-окси-3Н-индол-3-илидин)метил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоксамид (рис.7).

Рис. 7. Структурная формула сунитиниба.

Сунитиниб является низмоколекулярным соединением, связывается с высокой афинностью с тирозинкиназными рецепторами VEGF, PDGF и C-Kit рецептором, ингибируя их аутофосфорилирование и дальнейшую передачу внутриклеточного сигнала (Robert J. Motzer et al., 2006). Препарат выпускается в виде Сунитинибмалата для перорального введения. Проявляет антиопухолевую активность при метастатическом раке почки и применяется в качестве препарата терапии второй линии (J. G. Christensen 2007), (Robert J. Motzer et al., 2006). Данные предклинических испытаний показали, что антиопухолевый эффект может быть вызван не только с ингибированием ангиогенеза, посредством связывания рецепторов VEGF и PDGF и блокирования сигнала тирозинкиназ, но и антипролиферативным действием на определенные раковые клетки. При терапии почечной карциномы препарат показал превосходство над стандартной терапией интерфероном-α.

Полученные за последнее время данные об участии VEGF в развитии диабетической ритинопатии позволили предложить анти-VEGF в качестве консервативного лечения диабетической ритинопатии. В клинической практике доступно несколько лекарственных препаратов, блокирующих биологическое действие VEGF: пегаптаниб (селективный ингибитор VEGF₁₆₅), ранибизумаб и бевацизумаб (блокаторы всех изоформ VEGF) (Кузьмин и др., 2009).

Пегаптаниб («Макуген», Eyetech Pharmaceuticals⁄Pfizer) — это связанный с полиэтиленгликолем нейтрализующий РНК-аптамер², обладающий максимально высоким аффинитетом³ к VEGF₁₆₅.

Рис.8 Структура Пегаптаниба и сайты его связывания.

Как было показано в эксперименте на грызунах, интравитреальное применение пегаптаниба значительно подавляет лейкостаз, патологическую ретинальную неоваскуляризацию и VEGF-опосредованную клеточную гиперфильтрацию (Ishida et al., 2004). FDA (Food and Drug Administration, США) одобрил применение пегаптаниба в лечении отечной формы возрастной макулярной дегенерации (ВМД) в декабре 2004 г.

Методы получения рекомбинатного VEGF₁₆₅ человека.

Получение rhVEGF₁₆₅ в эукариотической системе экспрессии

Как упоминалось ранее, нативная форма VEGF₁₆₅ содержит сайт гликозилирования (Asn75) и является гомодимером за счёт образования двух межцепочечных дисульфидных мостиков. Поэтому для получения биологически активной формы рекомбинантного VEGF использовали в качестве продуцентов эукариотические системы экспрессии. Такие как клеточные линии насекомых и ооциты китайских хомячков. Lee Seong-Baek с соавторами была описана методика получения rhVEGF₁₆₅ в ооцитах китайских хомячков (Lee Seong-Baek et al., 2008). Авторами была достигнута сверхпродукция целевого белка, составившая более 80 мг/л, и разработана методика выделения, включающая последовательные стадии хроматографической очистки. Выход белка после стадий очистки составил 48%.

Особенностью эукариотической экспрессии в отличии от прокариотической является то, что продуцируемый белок экскретируется в питательную среду, и не образует телец включения, таким образом, не требуется дальнейшая процедура экстракции с последующей ренатурацией. Таким образом, количество стадий до получения чистого белка сводится к минимуму. В приведённом обзоре (Lee Seong-Baek et al., 2008) стадия очистки была реализована в два этапа. Первым этапом хроматографической очистки была ионообменная хроматография на сорбенте HiTrap-SP (Amersham Biosciences). Фракции, содержащие rhVEGF₁₆₅, были дочищены на колонке HiTrapHeparin HP (Amersham Biosciences). В результате чистота белка составила 96%.

Отличие рекомбинантного белка полученного из CHO, от клеток насекомых, заключалось в структуре олигосахаридов и степени гликозилирования, которые наблюдались на SDS-PAGE электрофорезе.

В статье (Geum Young Lee et al., 2006) была представлена методика получения rhVEGF₁₆₅ в клетках насекомых. В них также как и в клетках млекопитающих осуществляются эффективное гликозилирование, димеризация за счёт образования межмолекулярных дисульфидных связей и секреция целевого белка в культуральная среду. В качестве клеток продуцентов авторы использовали клеточные линии Spodoptera frugiperda Sf21. Ген был получен из клеточной линии карциомы яичников и клонирован в бакуловирусную систему экспрессии. Экспрессия целевого белка составила 20 мг на литр среды. Полученный белок очищали от компонентов культивационной среды трёхступенчатой хроматографией. Первый шаг включал в себя аффинную хроматографию на гепарин сефарозе. Элюат, содержащий целевой белок был сконцентрирован на центриконом 30 кДа и нанесён на колонку заполненную катионообменой смолой Resource S (GE Healthcare). Элюцию осуществляли линейным градиентом раствора NaCl. Далее элюат был дочищен методом быстрой жидкостной хроматографии (FPLC) на обращено-фазовом сорбенте Resource RPC. На выходе было получено 3 мг с литра культуральной среды. Таким образом, общий выход стадии очистки составил 15%.

Получение rhVEGF₁₆₅ в прокариотической системе экспрессии

Биологическая активность VEGF₁₆₅ не зависит от гликозилирования Asn 75 (D. Peretz et al., 1992) поэтому, стало возможным, использование прокариотической системы экспрессии для получения терапевтически активных форм.

Бактериальная система экспрессии легко масштабируема и даёт возможность получить VEGF менее дорогостоящим способом в более короткие сроки (F. Baneyx, 1999; Graumann and Premstaller, 2006; Swartz, 2001). В литературе были описаны способы получения растворимых форм VEGF₁₆₅ и VEGF₁₂₁ виде гибридного белка (Arora, 1999; Kim, 2007). Литературе имеются многочисленные публикации по получению VEGF165 в составе теле включений (Scrofani et al., 2000; Morera et al., 2006).

В статье (Shelly A. Pizarro et al., 2010) авторами описан способ получения рекомбинантного VEGF 165 в бактериальной системе экспрессии выход, которого составил 9 г с литра биомассы, что на мой взгляд вызывает сомнение. Представлена стратегия очистки, включающая три шага хроматографирования. Ферментация биомассы осуществлялась в режиме «фед-бетч», за счёт чего достигалась так называемая высокая клеточная плотность. Синтезированый белок образовывал тельца включения, поэтому после дезинтеграции бактериальных клеток было необходимо осуществить экстракцию белка из телец включения с последующим рефолдингом. Хроматорафическая стадия включала последовательное использование хроматографии смешанного режима на сорбенте Capto™ MMC, далее применяли катионообменную смолу SP Sepharose HP и окончательную доочистку целевого белка осуществляли на гидрофобном сорбенте PhenylSepharose™ 6 FastFlow. Общий выход после стадий экстракции, ренатурации и хроматографии составил около 30%.

I-Liang Lee с соавторами описали методику экспрессии и очистки рекомбинантного VEGF 165 в бактериальных клетках E. сoli Tuner (DE3) pLacI (Novagen, Madison, WI) (I-Liang Lee et al., 2010). В качестве экспрессионного вектора авторами была использована pET-1. Целевой белок экспрессировался в виде телец включения. Поэтому, также как и в ранее описанной статье, перед авторами стояла задача солюбилизировать тельца и осуществить ренатурацию экстрагированного белок. Экстракцию белка из телец включения осуществляли буферным раствором содержащий 4 М мочевину. Полученный экстракт телец включения содержал денатурированную мономерную форму rhVEGF165. Ренантурацию белка осуществляли поэтапным разведением экстракта раствором 1 М L-аргенина содержащем небольшое количество окисленного глутатиона. После чего ренатурационную смесь разделяли на катионообменом сорбенте Mono S. Выход белка после описанной стадии составил 1 мг на литр бактериальной культуры.

Поиск по сайту: