АвтоАвтоматизацияАрхитектураАстрономияАудитБиологияБухгалтерияВоенное делоГенетикаГеографияГеологияГосударствоДомДругоеЖурналистика и СМИИзобретательствоИностранные языкиИнформатикаИскусствоИсторияКомпьютерыКулинарияКультураЛексикологияЛитератураЛогикаМаркетингМатематикаМашиностроениеМедицинаМенеджментМеталлы и СваркаМеханикаМузыкаНаселениеОбразованиеОхрана безопасности жизниОхрана ТрудаПедагогикаПолитикаПравоПриборостроениеПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРадиоРегилияСвязьСоциологияСпортСтандартизацияСтроительствоТехнологииТорговляТуризмФизикаФизиологияФилософияФинансыХимияХозяйствоЦеннообразованиеЧерчениеЭкологияЭконометрикаЭкономикаЭлектроникаЮриспунденкция

Материалы

Читайте также:
  1. GG ДРУГИЕ ОТХОДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ В ОСНОВНОМ НЕОГРАНИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ, КОТОРЫЕ МОГУТ СОДЕРЖАТЬ МЕТАЛЛЫ И ОРГАНИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ
  2. I. Нормативные материалы
  3. IV. Дидактические материалы для практических занятий
  4. IV. Материалы и полуфабрикаты
  5. V. ПРАВОВЫЕ АКТЫ И МАТЕРИАЛЫ СУДЕБНОЙ ПРАКТИКИ
  6. V.УЧЕБНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
  7. Абразивные материалы.
  8. Абсолютизм. Общая характеристика. Особенности стиля. Используемые композиционные решения, конструктивные элементы и строительные материалы. Ключевые здания. Ключевые архитекторы.
  9. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ
  10. Аппаратура, оборудование, средства измерения, сырье, материалы, реактивы
  11. Архитектура кхмеров. Общая характеристика. Особенности стиля. Используемые композиционные решения, конструктивные элементы и строительные материалы. Ключевые здания.
  12. АС ОТХОДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ В ОСНОВНОМ ОРГАНИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ, КОТОРЫЕ МОГУТ СОДЕРЖАТЬ МЕТАЛЛЫ И НЕОРГАНИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

 

· Реактивы

В работе использованы трис, акриламид, N,N’-метилен(бис)акриламид, персульфат аммония (Sigma), ТЕМЕД, уксусная кислота, этанол, SDS, бромфеноловый синий, 2-меркаптоэтанол, агар (Difco), дрожжевой экстракт (Sigma), ИПТГ (Sigma), бакто-триптон (Difco).

Т4-ДНК-лигаза (Fermentas, #EL0014), Т4-полинуклеотидкиназа (Fermentas, #EK0031), Taq ДНК-полимераза (Fermentas), эндонуклеазы рестрикции Nco I, Xho I, Xba I, Bam HI, Bgl II, Hind III, Eco RI.

· Плазмидный вектор

pET32b(+) (Novagen)

pTWIN1 (New England Biolabs)

· Бактериальные штаммы

E.coli ER2566 ([F- lamda- fhuA2 [lon] ompT lacZ:: T7 gene1 gal sulA11 D(mcrC- mrr)114::IS10 R(mcr-73::miniTn10-- TetS)2 R(zgb-210::Tn10) (TetS) endA1 [dcm])

E. coli Origami (DE3) ∆(ara–leu)7697 ∆lacX74 ∆phoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL F'[lac+lacI pro] (DE3) gor522::Tn10 trxB (KanR, StrR, TetR)4

В работе использовались настольные центрифуги Z 383K(Hermile) и Centrifuge 5430R (Eppendorf), (Heraeus); амплификатор (PTC-0200 DNA Engine Cycler) (Bio-Rad); сухой термостат DVE (Heraeus); качалку с термостатируемой камерой Certomat (ETH); источники постоянного тока: 2197 Power Supply (LKB), 2002 Power Supply (LKB), 2301 Macrodrive-l (LKB), 2301 Macrodrive-5 (LKB), Electrophoresis Power Supply EPS500/400 (Pharmacia); ультразвуковой дезинтегратор (Branson) MSE, pH-метр PB-11 (Sartorius); Спектрофотометр SmartSpec Plus (Bio-Rad, США); ламинарный шкаф Gelaire (Flow Lab.); УФ-трансиллюминатор (Desaga); весы аналитические (Mettler PM460); автоматические микропипетки (Gilson, Eppendorf).

 

· Питательные среды

LB: 1% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, pH 7.3

YT-бульон: 0,8 % бакто-триптон, 0,5 % дрожжевой экстракт, 0,5 % NaCl.

SOB: 2% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,01 М NaCl, 0,01 М KCl, 0,01 М MgCl2, 0,01 М MgSO4, pH 7,5

· Буферные растворы

50´ТАЕ (50-кратный буфер для электрофореза ДНК в агарозе):

2 М трис-ацетат, рН 8,0, 1 М Na-ацетат, 0,9 М NaCl, 50 мМ ЭДТА.

 

Буферные системы для денатурирующего белкового электрофореза:

Буфер для приготовления образцов - 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 3% SDS, 20% глицерин, 3% 2-меркаптоэтанол, 0,05% бромфеноловый синий;

Стоковый раствор 40% акриламид/1,3% N,N'-метилен-бисакриламид в воде.

LTB (буфер для разделяющего геля) 375 мМ трис-HCl, рН 8,8, 0,1%SDS;

UTB (буфер для концентрирующего геля) 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 0,1% SDS.

10×Буфер для Taq-полимеразы: 67 мМ трис-HCl, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01 % TWEEN-20, 1,5 мМ MgCl2.

10× Буфер для ДНК-лигазы фага Т4: 25 мМ трис-HCl, рН 7,8, 10 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ, 0,4 мМ рАТР.

10 ×Буфер для полинуклеотидкиназы фага Т4: 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ.

10X Buffer Tango™ (Fermentas): 33 мМ трис-ацетат (pH 7,9 при 37°C), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0,1мг/мл БСА.

10×Буфер для эндонуклеаз рестрикции Green (Fermentas):10мМ ТрисHCl (pH 7,5 при 37°C), 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА.

10×Буфер для эндонуклеаз рестрикции Orange (Fermentas):10мМ ТрисHCl (pH 7,5 при 37°C), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА.

 

Методы

 

Создание штамма продуцента ER2566/pTTS-VEGF165.

К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pET32b+ добавили 4 мкл 10×буфера Tango yellow (Fermentas), 4 мкл дистилированой воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестрикции Eco RI и Hind III. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0,5 мкг линеаризованного фрагмента pET32b+ добавили 5 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг олигонуклеотидного дуплекса TRX_STOP, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10×буфера для полинуклеотидкиназы фага Т4 и 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы фага Т4 (Fermentas). Реакционную смесь инкубировали при 4о С в течении 15 часов.

Ген Trx-stop-start амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В 50 мкл реакционной смеси, содержалось 10 нг матрицы из ранее полученной лигазной смеси, 0,2 мкмоль каждого праймера (PR-1, PR-2), 5 мкл 10´ буфера для Taq-ДНК-полимеразы, SdNTP (каждый в концентрации 0,4 мМ), 2 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Инкубацию проводили в ДНК-амплификаторе по следующей программе:

1) денатурация 40 сек. при 93°С, отжиг 40 сек. при 58°С, элонгация 30 сек. при 72°С (5 циклов);

2) денатурация 30 сек. при 93°С, отжиг 30 сек. при 60°С, элонгация 30 сек. при 72°С (24 цикла).

Продукт ПЦР очищали при помощи набора для очистки ПЦР-продуктов MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) согласно протоколу фирмы-производителя.

К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pTWIN1 (New England Biolabs) добавили 4 мкл 10×буфера Orange, 4 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестриции Xba I и Bam HI. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл очищенного экстракта, содержащего линеаризованный фрагмент pTWIN1 добавили 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10×буфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 5 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг олигонуклеотида TTS и 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4о С в течении 15 часов. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER2566 и рассеивали их на твёрдой питательной среде. Из выросших колоний выделяли плазмиду набором QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pTTS добавили 2 мкл 10×буфера Green (Fermentas), 6 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестрикции Xba I и Xho I. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0.5 мкг линеаризованной плазмиды pTTS добавили 5 мкл раствора, содержащего 0,3 мкг ранее амплифицированного Trx-stop-start, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10×буфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4о С в течении 15 часов. В результате была получена плазмида pTTS-Trx. К 10 мл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pTTS-Trx добавили 2 мкл 10×буфера Green (Fermentas), 6 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестрикции Sap I и Xho I. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0,5 мкг линеаризованной плазмиды pTTS Trx добавили 5 мкл раствора, содержащего 0,3 мкг гена hVEGF165, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10×буфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4о С в течении 15 часов. В результате была получена плазмида pTTS-VEGF165.

Культивирование штамма ER2566/pTTS-VEGF165

Плазмидой pTTS-VEGF165 трансформировали компетентные клетки E. coli ER2566. 300 мл клеточной суспензии перенесли в питательную среду LB объёмом 25 мл содержащую ампицилин (100мкг/мл) инкубировали при 37оС на шейкере при 200об/мин в течении 16 часов. Ночную культуру объёмом 25 мл рассадили в питательную среду 2YT объёмом 250 мл, содержащую ампицилин (100мкг/мл) и инкубировали при 37оС до оптической плотности культуральной среды 0,8 ед. После чего добавляли ИПТГ до конечной концентрации последнего 100 мкг/мл. Инкубировали в течении 4 часов при 37оС.

Выделение и очистка hVEGF165.

Биомассу штамма ER2566/pTTS-VEGF165 (5г)ресуспендировали в 50 мл буфера (50 мМ ТрисHCl, 5мМ ЭДТА, 0,2% PMSF, pH 9.0) и лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора (15 с, амплитуда 40%) во льду в течении 30 минут. После дезинтеграции гомогенат центрифугировали в течение 30 мин (15000g, +4oC). Суммарное содержание белка в полученном супернатанте составило 473 мг. Осветлённый лизат объёмом 50 мл разбавили дистиллированной водой до объёма 100 мл и нанесли со скоростью 1 мл/мин на колонку (20 мл) заполненную анионообменым сорбентом Q XL уравновешенным буфером А (20 мМ ТрисHCl, 1 мМ ЭДТА, pH 9,0). Элюировали градиентом буфера Б (20 мМ ТрисHCl, 1 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, pH 9,0) 0% до 70% со скоростью 1,5 мл/мин. Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Фракции, содержащие hVEGF 165, были объединены. Выход белка составил 7 мг с литра культуры.

Создание штамма продуцента Origami(DE3) /pTrx-VEGF165

К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг гена hVEGF165 фланкированного сайтами Xho I и Nco I и 0,3 мкг плазмиды pTVG добавили 4мкл 10×буфера Tango 4 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестриции Xho I и Nco I. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали продукты ферментативного расщепления из агарозного геля набором фирмы QIAGEN. К 15 мкл экстракта добавили 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10×буфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4о С в течении 15 часов. В результате была получена плазмида pTrx-VEGF165.

Культивирование штамма Origami(DE3)/ pTrx-VEGF165

Плазмидой pTrx-VEGF165 трансформировали компетентные клетки E. coli Origami (DE3). 300 мл клеточной суспензии перенесли в питательную среду LB объёмом 25 мл содержащую ампицилин (100мкг/мл) и оставили инкубироваться при 37 оС на шейкере при 200 об/мин в течении 16 часов. Ночную культуру рассадили в питательную среду SOB объёмом 250 мл, содержащей ампицилин (100 мкг/мл) и инкубировали при 30 оС до оптической плотности культуральной среды 0,8. После чего добавляли ИПТГ до конечной концентрации последнего 100 мкг/мл. Инкубировали в течении 16 часов при 30 оС.

Выделение и очистка Trx-hVEGF165.

Биомассу E. coli Origami/pTrx-VEGF165 (1 г.) гомогенизировали в 15 мл буфера (50 мМ (Трис)2SO4, 5мМ ЭДТА, 0,2% PMSF, pH 10.0) и лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора (15 с, амплитуда 40%) во льду в течении 30 минут. После дезинтеграции лизат центрифугировали в течение 30 мин (15000g, +4oC). Суммарное содержание белка в полученном супернатанте составило 117 мг. Концентрацию белка определяли методом Бредфорд по стандартному раствору БСА. Супернатант объёмом 15 мл разбавили дистиллированной водой до 30 мл и нанесли со скоростью 1 мл/мин на колонку HiTrap Heparin Sepharose (5 мл) предварительно уравновешенную буфером А (20 мМ (Трис)2SO4, 1 мМ ЭДТА, pH 8.5). Элюировали в течении 50 мин градиентом буфера Б (20 мМ (Трис)2SO4, 1 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, pH 8.5) 0% до 100% со скоростью 1,5 мл/мин. Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Фракции, содержащие ГБ, были объединены. Количество гибридного белка составило 14.8 мг. Описанную операцию провели ещё раз. Объединённые фракции c двух разрушений содержащие 26,3 мг гибридного белка в 54 мл концентрировали на приборе для ультрафильтрации Amicon (мембрана YM 30) в 4 раза. В результате получили 13 мл раствора с концентрацией ГБ 1,63 мг/мл.


1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |

Поиск по сайту:

Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Студалл.Орг (0.005 сек.)