Результаты и обсуждение

В ходе выполнения курсовой работы на тему «Получение рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста» нами был осуществлён химико-ферментативный синтез из перекрывающихся олигонуклеотидов гена человеческого VEGF₁₆₅. Ген hVEGF₁₆₅ был оптимизирован по встречаемости кодонов для экспрессии в E. coli. Он был клонирован в экспрессионный вектор pET-23d(+) и получен штамм продуцент E. coli ER2566/ pER-VEGF₁₆₅. Однако, продукция целевого белка hVEGF₁₆₅ в клетках E. coli ER2566 была незначительной.

В статье (Hyo Jin Ihm, et al., 2008) была предложена «стоп старт» конструкция для бактериальной системы экспрессии косного морфогенного белка. Авторы отмечали высокий уровень экспрессии BMP-2 за счёт сопряжённой транскрипции мРНК BMP-2 с тиоредоксином. На подобии описанной в литературе конструкции было решено клонировать ген hVEGF₁₆₅ под стоп кодон тиоредоксина. Кодирующая последовательность тиоредокцина была взята из вектора pET32b+. В кодирующую последовательность тиоредоксина была встроена по сайтам EcoR I и Hind III вставка TRX_STOP. Вставка содержала стоп кодон ТАА, старт кодон ATG и следующий за ним сайт рестрикции Sap I.

Рис. 9. Схема вставки TRX_STOP.

Рис. 10. Схема клонирования вставки Trx STOP в вектор pET32b+

Полученную последовательность тиоредоксин TRX_STOP переклонировали по сайтам Nde I и Xho I в вектор pTTS, производный вектора pTWIN1 (Рис. 11).

Вектор pTTS был получен из коммерчески доступного вектора pTWIN1. Из вектора pTWIN1 был удалён участок фланкированный сайтами Xba I и Bam HI и по образовавшимся липким концам была лигирована вставка, содержащая сайт рестрикции Xho I(Рис. 12).

Рис. 11. Схема олигонуклеотидной вставки TTS.

Рис. 12. Схема получения плазмиды pTTS

Амплифицированный ген TrxSTOP был клонирован в вектор pTTS по сайтам рестрикции Xba I и Xho I (Рис.13).

Рис. 13. Схема получения плазмиды pTTS-TrxSTOP

Из плазмиды pTTS-TrxSTOP был вырезан фрагмент фланкированный сайтами Sap I и Xho I. По образовавшимся липким концам лигировали амплифицированный ген hVEGF₁₆₅. В итоге, была получен плазмидный вектор pTTS-VEGF₁₆₅ (Рис.14).

Рис. 14. Схема получения плазмиды pTTS- VEGF₁₆₅.

Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER2566 и высеивали на твёрдую питательную среде LB Agar, содержащую 100 мкг/мл ампицилина. Полученные колонии рекомбинантов анализировали на содержание и уровень экспрессии тиоредоксина и hVEGF₁₆₅ методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. На основании данных SDS ПААГ электрофореза были отобраны клоны №2,3 для дальнейшей работы.

Рис. 15. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов различных клонов E. coli ER2566/ pTTS- VEGF₁₆₅. Где A -h VEGF₁₆₅, B -тиоредоксин.

Из клонов № 2, 3 выделили плазмидную ДНК (pTTS-hVEGF₁₆₅). Плазмидной ДНК клона № 2 (pTTS-hVEGF₁₆₅) трансформировали клетки E. coli ER2655 и осуществили наработку биомассы ER2566/pTTS-hVEGF₁₆₅. Полученную биомассу лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора. Осветлённый лизат после центрифугирования хроматографировали на анионообменной смоле Q Sepharose (GE Healthcare). Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях на наличие целевого белка. Фракции, содержащие 90% hVEGF₁₆₅, были объединены. В объединенных фракциях методом Бредфорд определяли концентрацию белка. В результате конечный выход целевого белка составил 7 мг с литра культуры. Не смотря на низкий выход целевого белка, продукция тиоредоксина была значительной, что отчётливо видно на хроматограмме. (Рис.15).

Таблица 1. Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF₁₆₅ из биомассы E. coli ER2566/ pTTS- VEGF_165.

Получение гибридного белка Trx-hVEGF₁₆₅

На основании результатов ранее описанного эксперимента по получению hVEGF₁₆₅ с помощью «стоп старт» конструкции было решено осуществить получение hVEGF₁₆₅ в виде химерного белка. Так как уровень продукции тиоредоксина, несмотря на низкий выход hVEGF₁₆₅, был, достаточно, высокий.

В качестве экспрессионного вектора решили выбрать ранее полученный в лаборатории вектор pTVG производный вектора pET32 b(+). Вектор pTVG содержит ген тиоредоксина, последовательность кодирующую сайт TEV протеазы и удобный полилинкер. Ген hVEGF₁₆₅ был клонирован в плазмиду pTVG по сайтам Xho I и Nco I. В результате получили плазмиду pTVG-VEGF₁₆₅ (Рис. 16). В качестве штамма носителя взяли E. coli Origami (DE3).

За счёт делеций гена глутатион редуктазы (gor522) и тиоредоксин редуктазы (trxB) биосинтез hVEGF165 в штамме Origami (DE3) идёт с образованием внутри и межмолекуляных дисульфидных мостиков стабилизирующих молекулу белка и способствующие правильному фолдированию молекулы.

Рис.16. Схема клонирования hVEGF₁₆₅ в pTVG.

Данной плазмидой трансформировали клетки Origami (DE3) и осуществили наработку биомассы Origami (DE3)/pTVG-hVEGF₁₆₅. Полученную биомассу дезинтегрировали с помощью ультразвукового дезинтегратора. Осветленный лизат хроматографировали на колонке HiTrap Heparin Sepharose. За счёт наличия на С конце молекулы VEGF₁₆₅ 25 аминокислотных остатка, несущих сайты аффиности к гепарину (N. Ferrara, 2010) было решено фракционировать белки осветленного клеточного лизата на гепарин сефарозе.

Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Объединяли фракции, в которых содержание ГБ превышало 90%. Фракции, содержащие ГБ концентрировали методом ультрафильтрации на мембране YM 30. К концентрату, содержащему гибридный белок, была добавленная TEV протеаза в соотношении субстрат – фермент 100:1 соответственно. Протеолитическое расщепление было не значительным, менее 40% (Рис. 17.).

Рис. 17. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ). Результаты протеолитического расщепления ГБ TEV протеазой. Где A - гибридный белок (Trx-hVEGF₁₆₅), B -тиоредоксин.

Вероятной причиной низкого уровня протеолитического расщепления были неспецифические взаимодействия hVEGF₁₆₅ с тиоредоксином, экранировавшие сайт TEV.

Таблица 2. Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF₁₆₅ из биомассы Origami (DE3)/pTVG-hVEGF₁₆₅

Получение гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅.

Высокий уровень экспрессии гибридного белка Trx-hVEGF₁₆₅ подтвердил правильность выбранного способа продукции целевого белка. Однако, трудности возникшие на стадии сайт специфичного протеолитического расщепления TEV протеазой были, скорей всего, вызваны специфической природой тиоредоксина, влияющего на фолдинг молекулы гибридного белка. В результате снижалась доступность сайта TEV для TEV протеазы. Поэтому мы решили использовать в качестве лидерного полипептида белок с принципиально другой структурой, а также обладающего небольшой молекулярной массой в сравнении с молекулой тиоредоксина. Таким образом, было решено создать конструкцию, содержащую на N конце хитинсвязывающий домен (CBD) соединённый с hVEGF₁₆₅ через сайт TEV.

CBD фрагмент амплифицировали с pTWIN1 с помощью праймеров Т7-prim и CBD2, содержащими сайты рестриктаз Xba I и Bgl II соответственно. В качестве вектора была выбрана плазмида pET-32b(+). Данный вектор содержит в полилинкерной последовательности сайты рестрикции Xba I и Bgl II(Рис. 19), по которым и была произведена вставка амплифицированного фрагмента с учетом корректной рамки считывания (Рис. 18).

Рис. 18. Схема получения плазмиды pET-CBD

Рис. 19. Полилинкерная последовательность вектора pET-32b(+).

Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е.coli ER2566. Суспензию трансформированных клеток рассевали на чашки с селективной средой. Клоны, полученные при высевании трансформированных клеток на агаризованную среду пересевали в жидкую среду с добавлением ампициллина для выращивания и отбора клонов.

Отбор клонов осуществляли по результатам данный полученных при электрофорезе клеточных лизатов клонов в ПААГ. (Рис.20).

Рис. 20. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов клонов E. coli ER2566/ pET-CBD

Из отобранных клонов выделили плазмидную ДНК для дальнейшей работы.

Получение экспрессионного вектора pCBD-VEGF₁₆₅.

Ранее полученный ген человеческого VEGF₁₆₅ был амплифицирован при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, содержащими сайты эндонуклеаз рестрикции Bgl II и Xho I, в качестве матрицы использовали плазмиду pTVG-VEGF₁₆₅.

Амплифицированый ген hVEGF₁₆₅ был клонирован по сайтам Xho I и Bgl II в ранее созданную для этого генетическую конструкцию pET-CBD. В результате получили плазмиду pCBD-VEGF₁₆₅ (Рис. 21).

Рис.21. Схема получения плазмиды pCBD-hVEGF₁₆₅.

Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER 2566, которые затем рассеивали на твёрдой питательной среде, с целью отбора клонов. В результате было проверенно 9 клонов на наличие экспрессии гибридного белка (Рис. 22).

Рис.22. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов клонов E. coli ER2566/pCBD-hVEGF₁₆₅. Где А – гибридный белок CBD-hVEGF₁₆₅.

Для подтверждения строения вставки гена рекомбинантного белка, полученные плазмиды были просеквенированы (в компании Евроген).

Из биомассы клона №4 была выделена плазмида pCBD-VEGF₁₆₅ для дальнейшей работы.

Получение штамма продуцента гибридного белка CBD-VEGF₁₆₅.

Выделенной плазмидой pCBD-VEGF₁₆₅ трансформировали клетки E. coli Origami (DE3). Полученный штамм продуцент проверяли на наличие продукции гибридного белка. Элетрофорез проводили в восстанавливающих и в невосстанавливающих условиях с целью обнаружения димера гибридного белка. Электрофореграмма в невосстанавливающих условиях показала наличие димера химерного белка (Рис. 23). Целевой белок после ультразвуковой дезинтеграции биомассы клетки E. coli Origami (DE3)/ pCBD-VEGF₁₆₅ в основном присутствовал в растворённой фракции. Таким образом, нам удалось избежать образования телец включения, характерных для гетерологической экспрессии многих белков в клетках E. coli.

Рис. 23.Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) в восстанавливающих и невостанавливающих условиях. Где A - димер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅, B - мономер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅.

Подбор условий культивирования штамма E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅

В ходе дальнейшей работы был проведен подбор оптимальных условий культивирования штамма-продуцента. Для этого в процессе культивирования клеток после добавления ИПТГ каждый час отбирались пробы биомассы. Культивирование проводили при 30^о С.

Результаты данного эксперимента представлены на рис. 24.

Рис. 24. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) образцов биомассы E. coli Origami (DE3)/pCBD-hVEGF₁₆₅ после индукции ИПТГ. Где А – гибридный белок CBD-VEGF_165.

Из полученной электрофореграммы видно, что оптимальное время культивирования клеточной культуры E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅ 15-16 часов после добавления ИПТГ.

Выделение и очистка гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅.

Полученный продуцент E.coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅ культивировали при 37 ⁰С до оптической плотности 0,6-0,7, затем добавляли ИПТГ и выращивали при 30 ⁰С в течении 16 часов.

Биомассу штамма-продуцента E.coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅ подвергали ультразвуковой дезинтеграции в буфере, содержащем 2 М мочевину. Центрифугированием отделили растворимую фракцию, содержащую гибридный белок, от нерастворимого осадка. Используя сродство VEGF₁₆₅ к гепарину, гибридный белок, содержащийся в осветлённом лизате, очищали от белков E. coli на колонке HiTrap HP Heparin-Sepharose. Полученные фракции анализировали на наличие димера гибридного белка с помощью SDS-ПААГ электрофореза в невосстанавливающих условиях.

Рис. 25. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) в невостанавливающих и восстанавливающих условиях фракций после элюции с гепарин сефарозы. Где A – димер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅. B – мономер гибридного белка CBD-hVEGF_165.

По результатом электрофореза в невостанавливающих условиях были отобраны фракции для дальнейшей работы.

Полученные фракции были объедены и сконцентрированы методом ультрафильтрацией на мембране YM 30 с целью дальнейшего протеолитического расщепления гибридного белка TEV-протеазой.

Протеолитическое расщепление гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅ TEV протеазой.

Концентрат нанесли на колонку, заполненную хитиновым сорбентом (New England Biolabs). Колонку заполнили буферным раствором, содержащим TEV протеазу, инкубировали при 37^оС на 15 часов. Продукты протеолитического расщепления элюировали буферным раствором А. Элюат и хитиновый сорбент анализировали методом SDS-электрофорезом.

Рис 26. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) результаты протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка на колонке заполненной хитиновым сорбентом. Где A - димер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅, B – мономер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅, C – hVEGF ₁₆₅.

Эффективность ферментативного гидролиза составила менее 50%. В качестве альтернативного пути осуществления протеолитического расщепления ГБ было решено отказаться от предварительной сорбции на хитиновый сорбент, а расщеплять, непосредственно, в растворе. К полученному концентрату добавили экстракт тел включения TEV в соотношении фермент-ГБ 1:100, а также добавили 1М раствор дитиотриэтола до концентрации последнего в реакционной среде 1 мМ. Инкубировали в течение 15 часов при температуре 37^оС и слабом перемешивании. Гидролиз гибридного белка прошёл, практически, полностью (Рис. 27).

Рис. 27. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ). Кинетика протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка в растворе. Где A – димер hVEGF₁₆₅, B – мономер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅, C – мономер hVEGF₁₆₅.

Далее смесь, содержащую продукты ферментативного гидролиза, фракционировали, с помощью аффинной хроматографии на сорбенте гепарин сефароза по ранее описанной методики. Фракции содержащие целевой белок очищали с помощью ВЭЖХ на колонке Диасорб С18 (Рис. 28).

Рис. 28 Профиль ВЭЖХ хроматографии на колонке Диасорб С18 фракций, содержащих hVEGF₁₆₅

.

hVEGF165 чистотой 98% элюировался с колонки начиная 18,6 мин по 19,1 минуту. Полученный элюат, содержащие чистый rhVEGF₁₆₅ был лиофилизирован. Итоговый выход целевого белка составил 22,4 мг с литра культуры.

Таблица 3. Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF₁₆₅ из биомассы E. coli Origami/pCBD-VEGF_{165 .}

Заключение

Нами было создано несколько генетических конструкций для бактериальной системы экспресии человеческого васкулярного эндотелиального фактора роста hVEGF₁₆₅ (pTrx-stop-hVEGF₁₆₅, pTrx-hVEGF₁₆₅, pCBD-hVEGF₁₆₅). Отобрана наиболее эффективная из них и подобран оптимально подходящий штамм E. coli. для гетерологической экспрессии данного ростового фактора. Отработана методика и схема выделения целевого белка.

Выводы

1. Получен высокопродуктивный штамм продуцент hVEGF₁₆₅ E. coli Origami (DE3)/pCBD-hVEGF₁₆₅.

2. Определены оптимальные условия культивирования.

3. Разработана схема выделения и очистки hVEGF₁₆₅.

Поиск по сайту: