Работа №1. Определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом

Принцип метода. Ферментативный метод определения глюкозы основан на действии глюкозооксидазы и предназначен для специфического определения глюкозы в биологических жидкостях в присутствии различных сахаров и других редуцирующих веществ неуглеводной природы. Глюкозооксидаза (КФ 1.1.3.4) относится к флавопротеинам (кофермент – ФАД). Глюкоза окисляется при действии фермента с образованием Н₂О₂ и глюконата. Возникшую перекись водорода определяют реакцией, катализируемой ферментом пероксидазой, с последующим окислительным азосочетанием производного фенола с 4-аминофеназоном (хромогенный кислородный акцептор). В ходе реакции образуются окрашенные в розовый цвет продукты. Количественное определение глюкозы заключается в измерении интенсивности окраски красителя и сравнении оптической плотности испытуемой пробы с окраской калибровочного раствора глюкозы.

Порядок выполнения работы:

1). В пробирку №1 (опыт) вносят 0,01 мл сыворотки крови и 1 мл рабочего раствора

(ферментно - хромогенная смесь)

2). В пробирку №2 (контроль) вносят 0,01 мл стандартного раствора глюкозы

(концентрация глюкозы 10 ммоль/л) и 1 мл рабочего раствора

3) Пробирки перемешивают и инкубируют в термостате 30 минут при 37^оС

4) Измеряют оптическую плотность опытной пробы (А_опыта) и контроля (А_{контроля})

на ФЭКе против Н₂О _дистил при длине волны 540 нм

5) Рассчитывают содержание глюкозы по формуле:

Глюкоза (ммоль/л) = (10×А_опыта): А_{контроля}

В выводах сопоставить величины нормального содержанию глюкозы в крови с данными, полученными в результате проделанной работы.

Клинико-диагностическое значение. Благодаря существованию сложных регуляторных механизмов, концентрация глюкозы в крови сохраняется относительно постоянной – 3.3-5.5 ммоль/л. Концентрация глюкозы в крови зависит от строгой регуляции интенсивности процессов распада и синтеза гликогена, глюконеогенеза, скорости всасывания глюкозы в ЖКТ и окисления ее в тканях с высвобождением энергии.

Гипогликемия – понижение содержания глюкозы в крови. Гипогликемия наблюдается при длительном голодании; сопровождает заболевания поджелудочной железы, опухолевый рост, тяжелые поражения печени, эндокринные нарушения; наблюдается при передозировке инсулина. При гипогликемии ниже 2.7 ммоль/л возникает риск развития гипогликемической комы.

Гипергликемия – повышенное содержание глюкозы в крови (более 6 ммоль/л). Физиологическая гипергликемия наблюдается после приема пищи, при эмоциональном стрессе. Гипергликемия сопровождает эндокринные нарушения (сахарный диабет, гипертиреоз), острый и хронический панкреатиты, заболевания печени, сердечно-сосудистые заболевания и др. При гипергликемии выше 22 ммоль/л развивается гипергликемическая кома.